从革兰氏阴性细菌制备原生质球

摘要

来源：Figueroa, D. et. al. 细菌球状体与原生质体的制备及可视化以表征抗菌肽的定位。 J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了从杆状革兰氏阴性菌制备原生质球的方法。将细菌在抗生素存在下培养，以形成伸长的丝状体。用高渗溶液洗涤这些丝状体，然后用裂解缓冲液处理以去除外层细胞壁。通过低渗处理形成原生质球，并用预冷的等渗溶液稳定，于低温条件下保存。

方案

1. 溶液配制

注意：请按步骤1.1–1.9所述配制溶液，以制备大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）原生质球

1. 准备1 M 三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐（Tris-Cl），pH 7.8，通过溶解10.34 g Tris·HCl 和 4.17 g 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris·OH）于 50 mL 蒸馏水（dH₂O）置于 125 毫升锥形瓶。通过25毫米滤器过滤除菌 使用带有0.2 µm膜的mm注射器滤器过滤，并在锥形管中室温保存。
2. 配制溶液 A（20 毫摩尔氯化镁（MgCl₂），0.7 M 蔗糖，10 mM Tris-Cl，pH 7.8）通过溶解 0.10 g MgCl₂ (95.2 g/mol）和 11.98 g 蔗糖（342.3 克/摩尔）在25 mL dH₂O，置于125 mL 锥形瓶。加入 500 µL 1 M Tris-Cl（pH 7.8）并将体积调至 50 毫升。通过25 使用带有0.2 µm滤膜的mm注射器滤器过滤，并在锥形管中室温保存。
3. 制备溶液B（10 mM MgCl₂, 0.8 M 蔗糖，10 mM Tris-Cl，pH 7.8）通过溶解 0.05 g MgCl₂ (95.2 g/mol）和 13.69 克蔗糖（342.3 g/mol) 在 25 mL dH₂O，置于125 mL 锥形瓶。加入 500 µL 1 M Tris-Cl（pH 7.8）并调整体积至 50 毫升。通过25 使用带有0.2 µm膜的mm注射器滤器过滤，并在锥形管中室温保存。
4. 制备 0.8 M 蔗糖通过溶解 13.69 g 蔗糖（342.3 g/mol) 在 50 mL dH₂O，置于125 毫升锥形瓶。通过25毫米滤器过滤除菌 使用带有0.2 µm膜的mm注射器滤器过滤，并在锥形管中室温保存。
5. 准备 5 mg/mL 脱氧核糖核酸酶 我（DNase I) 通过溶解 0.015 g DNase 3中的I mL 的 dH₂O 置于 50 毫升烧瓶。通过25 使用带有0.2 µm滤膜的mm注射器滤器过滤溶液，分装至微量离心管中，于−20 °C保存。
6. 制备 0.125 乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0，通过溶解 0.698 g 乙二胺四乙酸二钠二水合物（372.2 g/mol) 加入 15 mL dH₂O，置于125 毫升烧瓶。通过25 使用带有0.2 µm滤膜的mm注射器滤器过滤，并将滤液收集于锥形管中，室温保存。
7. 通过溶解 0.03 克头孢氨苄制备 600 µg/mL 的头孢氨苄溶液 克头孢氨苄水合物（365.404 g/mol) 在 50 mL 的 dH₂O 置于 125 毫升锥形瓶。通过25毫米滤器过滤除菌 使用带有0.2 µm滤膜的mm注射器滤器过滤，并将滤液收集于锥形管中，4 °C保存。
8. 准备 5 mg/mL 溶菌酶，通过溶解 0.015 3 克溶菌酶 mL 的 dH₂O 加入 50 毫升烧瓶。通过25 使用带有0.2 µm滤膜的mm注射器滤器过滤溶液，分装至微量离心管中，于−20 °C保存。
9. 配制3% w/v胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），溶解30 TSB 克数在 1 中 L 的 dH₂O 在 2 L 锥形瓶。将溶液分装至含有 25 的锥形瓶中 毫升或100 用于制备大肠杆菌原生质球或巨大芽孢杆菌原生质体的 TSB 培养基，每份 100 mL。将装有培养基的锥形瓶进行高压灭菌以消毒液体培养基。灭菌后的 TSB 可在室温或 4 °C 下保存。
10. 制备溶液 C（1 M 蔗糖，0.04 M 马来酸盐，0.04 M MgCl₂，pH 6.5）通过溶解 34.23 g 蔗糖（342.3 克/摩尔），0.46 g 马来酸 (116.07 克/摩尔），以及 0.38 g MgCl₂ (95.21 g/mol) 在 100 mL 的 dH₂O 加入 250 毫升烧瓶中，调节pH至6.5，用25毫米滤器过滤除菌 使用带有0.2 µm滤膜的mm注射器滤器过滤，并将滤液收集于锥形管中，室温保存。

2. 过夜培养物的制备

注意：执行第2-3节时应采用适当的无菌技术。如需要，可使用含有抗生素抗性质粒的菌株，以减少潜在污染。若使用具有抗生素抗性的菌株，需在步骤2.1以及步骤3.1–3.2中加入相应的抗生素。

1. 使用无菌移液器吸头挑取单个细菌菌落，接种于含有 2–3 mL 3% w/v TSB 的 14 mL 培养管中，制备过夜培养物。在 37 °C 条件下振荡培养 16–21 小时。

3. 革兰氏阴性 E. coli 原生质球的制备

1. 在250 mL锥形瓶中，将过夜培养物按1:100比例接种于25 mL含3% w/v TSB的培养基中，于37 °C振荡培养约2.5 h，直至菌液在600 nm处的光密度达到0.5–0.8。使用分光光度计测定光密度。
2. 在250 mL锥形瓶中，将该培养物按1:10比例稀释于30 mL含3% w/v TSB的溶液中，加入终浓度为60 µg/mL的头孢氨苄（347.4 g/mol），于37 °C振荡培养2.5小时，以获得长度约为50–150 µm的单细胞丝状体，可在光学显微镜下以1,000倍放大观察图1B).
3. 通过在 1,500 x g 条件下离心菌液收集菌丝 g4 °C 下离心 4 分钟。倾去上清液并弃除，保留沉淀。
4. 轻轻加入1 mL 0.8 M蔗糖溶液洗涤沉淀物，注意不要扰动沉淀。孵育1分钟，然后弃去上清液，避免扰动沉淀。
5. 向沉淀中依次加入 150 µL 1 M Tris-Cl（pH 7.8）、120 µL 5 mg/mL 溶菌酶、30 µL 5 mg/mL DNase I 和 120 µL 0.125 M EDTA，混匀后于室温孵育 10 分钟。
6. 使用移液枪，在1分钟内将1 mL溶液A缓慢加入3.5步骤中制备的溶液中，同时用手轻轻旋摇溶液。室温孵育4分钟。
7. 将7 mL的4 °C溶液B加入两个15 mL锥形管中。将步骤3.6中制备的溶液等量加入这两个管中。在1,500 x g，4 °C 下 4 分钟。
8. 使用血清学移液管，小心吸除除1以外的所有液体-2 mL上清液，注意不要扰动沉淀。使用P1000移液器轻轻吹打沉淀，使其重悬。取样后在光学显微镜下以1,000倍放大观察，通过目视检查确认球状体的形成情况。图1C).
9. 将原生质球在 -20 °C 保存一周，或直至完成三次冻融循环。

结果

图1：代表性图像 大肠杆菌. （A） E. coli 细菌，（B） 大肠杆菌 蛇，以及（C） E. coli 原生质球。图像在100倍放大下拍摄。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris HCl）	Sigma	T3253
三羟甲基氨基甲烷碱（Tris OH）	Sigma	T1503
氯化镁	Sigma	M8266
蔗糖	Sigma	S7903
溶菌酶	Sigma	L6876
脱氧核糖核酸酶 I	Sigma	D4527
乙二胺四乙酸	Sigma	106361	原始方案开发中使用 Sigma 106361；该货号已停产，由 ED2SS 取代
头孢氨苄水合物	Sigma	C4895
BBL 胰蛋白酶大豆肉汤	Fisher Scientific	B11768
马来酸	Sigma	M0375
Acrodisc 25 mm 注射器滤器，带 0.2 μm HT Tuffryn 膜	Pall Corporation	4192