从革兰氏阴性细菌制备原生质球

摘要

来源：Figueroa, D. et. al. 细菌球状体与原生质体的制备及可视化以表征抗菌肽的定位。 J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了从杆状革兰氏阴性菌制备原生质球的方法。将细菌在抗生素存在下培养，以形成伸长的丝状体。用高渗溶液洗涤这些丝状体，然后用裂解缓冲液处理以去除外层细胞壁。通过低渗处理形成原生质球，并用预冷的等渗溶液稳定，于低温条件下保存。

方案

1. 溶液配制

注意：请按步骤1.1–1.9所述配制溶液，以制备大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）原生质球

1. 准备1 M 三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐（Tris-Cl），pH 7.8，通过溶解10.34 g Tris·HCl 和 4.17 g 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris·OH）于 50 mL 蒸馏水（dH₂O）置于 125 毫升锥形瓶。通过25毫米滤器过滤除菌 使用带有0.2 µm膜的mm注射器滤器过滤，并在锥形管中室温保存。
2. 配制溶液 A（20 毫摩尔氯化镁（MgCl₂），0.7 M 蔗糖，10 mM Tris-Cl，pH 7.8）通过溶解 0.10 g MgCl₂ (95.2 g/mol）和 11.98 g 蔗糖（342.3 克/摩尔）在25 mL dH₂O，置于125 mL 锥形瓶。加入 500 µL 1 M Tris-Cl（pH 7.8）并将体积调至 50 毫升。通过25 使用带有0.2 µm滤膜的mm注射器滤器过滤，并在锥形管中室温保存。
3. 制备溶液B（10 mM MgCl₂, 0.8 M 蔗糖，10R....

结果

图1：代表性图像 大肠杆菌. （A） E. coli 细菌，（B） 大肠杆菌 蛇，以及（C） E. coli 原生质球。图像在100倍放大下拍摄。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris HCl）	Sigma	T3253
三羟甲基氨基甲烷碱（Tris OH）	Sigma	T1503
氯化镁	Sigma	M8266
蔗糖	Sigma	S7903
溶菌酶	Sigma	L6876
脱氧核糖核酸酶 I	Sigma	D4527
乙二胺四乙酸	Sigma	106361	原始方案开发中使用 Sigma 106361；该货号已停产，由 ED2SS 取代
头孢氨苄水合物	Sigma	C4895
BBL 胰蛋白酶大豆肉汤	Fisher Scientific	B11768
马来酸	Sigma	M0375
Acrodisc 25 mm 注射器滤器，带 0.2 μm HT Tuffryn 膜	Pall Corporation	4192