量化酶诱导的病原菌生物膜抑制作用

摘要

来源：Tay, S. B., et al. 利用工程化群体感应淬灭乳糖酶实现对致病性生物膜的抗毒力破坏。J. Vis. Exp. (2016)

该视频展示了一种定量检测病原菌生物膜生物量的方法，通过比较未经处理的对照样本与经群体感应淬灭酶处理的样本，评估酶的作用效果。该酶在细菌孵育早期干扰其信号传导，从而减少细胞黏附。经过清洗及后续孵育后，对照孔中形成致密的生物膜，而处理孔中生物膜的形成明显减少。采用阳离子染料对生物膜进行染色，并通过测定吸光度来评估生物膜的生物量。

方案

1. 结晶紫定量法检测生物膜形成 A. baumannii S1

1. 在摇床培养箱（30 °C，220 rpm）中，用5 mL的溶菌肉汤（LB）（胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L）培养Acinetobacter baumannii S1（A. baumannii）菌株，培养16小时。
2. 将A. baumannii S1菌液调整至600 nm处的光密度（OD₆₀₀）为0.8。使用96孔板，将菌液以1:100比例稀释后接种至新鲜LB培养基中，并加入10 µl纯化的GKL酶（40 mg/mL）；每孔最终体积为100 µl。
3. 同时制备对照组培养物，其中不添加任何酶。重复上述操作，以获得所需数量的重复样本。
4. 将96孔板盖上盖子，放入密封的10 L塑料容器中，在30 °C下孵育3小时后，轻轻移除培养基。
5. 向每孔中加入100 µl新鲜LB培养基，继续在30 °C下孵育21小时。
6. 第二次孵育结束后，轻轻移除所有培养基，用200 µl无菌水清洗浮游细菌细胞。清洗过程中应尽量减少对细胞的扰动。
7. 向每孔中加入100 µl 1%结晶紫溶液，室温孵育15分钟。随后用200 µl无菌水洗涤各孔以去除结晶紫溶液，重复洗涤两次。
8. 向每孔中加入100 µl 33%乙酸溶液，轻轻振荡孵育15分钟，使染料溶解。
9. 通过测定600 nm处结晶紫的吸光度来定量生物膜的形成量。结晶紫的量与所形成的生物膜量成正比。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨	BD	211705
酵母提取物	BD	212750
96孔板	Costar	3596
结晶紫	Sigma-Aldrich	C6158
乙酸	Lab-Scan	PLA00654X	注意：易燃
Synergy HT 微孔板读板仪	BioTek