酶介导抑制生物膜形成的显微评估

摘要

来源：Tay, S. B., et.al. 利用工程化群体感应淬灭乳糖酶实现对致病性生物膜的抗毒力破坏。 J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了通过引入一种破坏细菌细胞信号传导的酶来抑制生物膜形成的过程。该酶可阻止细菌产生胞外聚合物，从而减少在玻璃底微皿上生物膜的发育。最后，利用荧光凝集素和共聚焦激光扫描显微镜对生物膜结构进行可视化观察。

方案

1. 共聚焦激光扫描显微镜观察 A. baumannii S1 生物膜

1. 在摇床培养箱（220 rpm）中，于30 °C在LB培养基中培养5 ml的A. baumannii S1菌液16小时。

2. 将A. baumannii S1的培养物调整至OD₆₀₀为0.8。使用35 mm玻璃底µ-Dish，将细菌培养物（1:100稀释）接种至含30 µl纯化GKL酶（40 mg/ml）的新鲜LB培养基中；新培养物的终体积为1 ml。

3. 用盖子盖住 µ-培养皿，并将其放入一个密封的10 L塑料容器中。在30 °C下孵育µ-培养皿3小时，然后轻轻移除培养基。加入30 µl纯化的GKL酶和新鲜培养基，使总体积达到1 ml。在30 °C下继续孵育21小时。

4. 重复步骤1.3，将µ-培养皿在30 °C下再孵育24小时。然后，轻轻移除培养基。

5. 向µDish中加入500 µl用Hank's平衡盐溶液（HBSS）溶解的5 µg/ml Alexa Fluor 488标记的小麦胚芽凝集素（WGA），在37 °C孵育30分钟；此步骤可对形成的生物膜进行染色。移除染色液，用2 ml HBSS洗涤µ-Dish。重复洗涤步骤一次。

6. 加入500 µl溶于HBSS的3.7%甲醛，37 °C孵育30分钟，以将生物膜固定在µ-Dish上。用2 ml HBSS洗涤µ-Dish一次，然后完全去除溶液。固定有生物膜的µ-Dish可在暗处4 °C保存，待共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像前使用。

7. 对于共聚焦激光扫描显微镜成像和分析，使用63倍放大倍数，每张图像生成97个焦平面，每个焦平面间隔0.21 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨	BD	211705
酵母提取物	BD	212750
96孔板	Costar	3596
乙酸	Lab-Scan	PLA00654X	注意：易燃
μ-培养皿	Ibidi	80136
Alexa Fluor 488 标记的麦芽凝集素（WGA）	Invitrogen	W11261
汉克平衡盐溶液	Invitrogen	141475095
甲醛	Sigma-Aldrich	F8775	注意：腐蚀性
Synergy HT 微孔板读板仪	BioTek
1X-81 倒置荧光显微镜	Olympus