利用聚合酶链式反应检测二元培养物中的糖单胞菌

摘要

来源： Collins, A. J., et al., 从口腔中建立共生性 Saccharibacteria 的稳定二元培养物。J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了利用聚合酶链式反应（PCR）在与放线菌（Actinomyces）的二元共培养体系中检测黏胶球菌门（Saccharibacteria）的方法。该实验方案通过DNA扩增和凝胶电泳，验证宿主与寄生菌之间稳定的互作关系。

方案

1. 通过PCR确认Saccharibacteria感染
   1. 经过5次传代后，使用聚合酶链式反应（PCR）确认感染。5次传代可确保任何不生长的Saccharibacteria细胞数量已降低至使用25个PCR循环无法检测的水平。
   2. 配制PCR预混液。建议配方如下：对每个需要的PCR管，加入12.5 µL 2x PCR缓冲液、0.75 µL 10 µM正向引物（580F¹² - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C）、0.75 µL 10 µM反向引物（1177R¹³ - GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC）、1 µL 25 mM MgCl₂ 和9 µL水。通过涡旋充分混匀。
   3. 将24 µL预混液分装至0.2 mL PCR管中。向PCR反应体系中加入1 µL Saccharibacteria感染的培养物。将PCR管放入热循环仪中，执行以下程序：95 °C 初始变性5分钟，随后进行25个循环（95 °C 变性30秒、60 °C 退火30秒、72 °C 延伸30秒），最后在72 °C 延伸2分钟，然后在4 °C 保存。
   4. 将PCR产物上样并在1%琼脂糖凝胶中电泳。约600个碱基的条带表明存在Saccharibacteria。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Fisher Scientific	BP160-100
脑心浸出液肉汤（脱水粉末）	Becton-Dickinson	211059	或适用于目标生物的其他培养基
电泳电源	Bio-Rad	1645052
电泳装置	Bio-Rad	1704467
GoTaq Green Mastermix	Promega	M7122
Mastercycler Pro 温控循环仪	Eppendorf	950040025	或适用于 PCR 的同等温控循环仪
25 mM MgCl₂ 溶液	Promega	A3513
分子生物学级水	Fisher Scientific	BP2819100
P-1000 微量移液器	Gilson	F123601G
PCR 管（0.2 mL）	Fisher Scientific	14-230-205
移液器吸头 - 1000 μL	Fisher Scientific	02-717-166
SYBR Safe DNA 凝胶染料	ThermoFisher Scientific	S33102
胰蛋白胨大豆肉汤（脱水粉末）	Becton-Dickinson	211825	或适用于目标生物的其他培养基