从感染的宿主细胞中分离胞内病原菌

摘要

来源：Sigal, N., 等. 从巨噬细胞内增殖的单核细胞增生李斯特菌中提取RNA。 J. Vis. Exp. (2016).

本视频展示了从感染的小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中分离胞内病原菌的方法。首先使细菌与宿主细胞结合，随后洗去未结合的细菌。细菌内化后，加入抗生素以清除未内化的细菌。接着裂解宿主细胞，离心后将上清液过滤，使细菌截留在滤纸上，然后迅速冷冻并保存以供后续使用。

方案

注意：整个实验过程中，巨噬细胞在37 °C、5% CO₂的强制空气培养箱中孵育，仅在进行实验操作时短暂取出，所有操作均在II级生物安全柜中进行。Listeria monocytogenes细菌的操作遵循生物安全二级（BSL-2）规定。

1. 细胞准备与细菌感染（第1天和第2天）

1. 第1天
   1. 在145 mm培养皿中，以30 ml BMDM + 青霉素-链霉素培养基（表2）接种2.0 × 10⁷个骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）。每种待分析的细菌菌株接种3个培养皿。在37 °C、5% CO₂的强制通风培养箱中过夜培养。
   2. 在标准培养箱中，于30 °C条件下，在10 ml脑心浸液（BHI）培养基中启动野生型（WT）L. monocytogenes菌株10403S的过夜细菌培养。将培养管倾斜放置，不振荡。 
      注意：这些培养条件可上调鞭毛基因的表达，从而促进高效感染。
2. 第2天
   1. 将BMDM培养基（不含青霉素-链霉素抗生素）（表2）和磷酸盐缓冲液（PBS）预热至37 °C。
   2. 用25 ml预热的PBS洗涤巨噬细胞单层两次，以去除抗生素。加入30 ml新鲜的BMDM培养基。
   3. 取1.5 ml过夜细菌培养物，用PBS洗涤：在>14,000 × g条件下离心1分钟，弃去上清液，用移液器将细菌轻轻重悬于1.5 ml PBS中。重复该步骤两次。
   4. 用0.5 ml经洗涤的野生型L. monocytogenes过夜培养物感染每个巨噬细胞培养皿。若使用多个培养皿，每隔15分钟感染一个培养皿。此时间间隔可确保在感染结束时能够分别收获每个培养皿。
      注意：感染复数（MOI）通过将用于感染的细菌培养物进行系列稀释后涂布于BHI琼脂平板，并在37 °C培养24小时后计数菌落形成单位（CFU）来测定。使用0.5 ml野生型L. monocytogenes菌株10403S可获得约100的MOI（即每个巨噬细胞对应100个细菌CFU）。在分析细胞内生长缺陷的细菌突变体时，应考虑使用更高的MOI。
   5. 在37 °C培养0.5小时后，用PBS洗涤感染细胞两次，以去除未附着的细菌，然后加入30 ml预热的BMDM培养基。已附着的细菌将在接下来的0.5小时内被内化。
   6. 感染后1小时，加入30 µl庆大霉素（1:1,000稀释，终浓度为50 µg/ml），以杀死细胞外细菌。
   7. 通过将滤头安装在带有真空出口的收集液瓶上组装过滤装置。然后将滤膜（0.45 µm）置于滤头上，再放上圆柱形漏斗，并用金属夹固定各部件。准备预冷的无RNase水。
   8. 感染后6小时，按以下步骤从感染细胞中收获细菌。每个培养皿单独处理。
      注意：通常，L. monocytogenes在巨噬细胞中感染6小时可完成约1个对数级的生长。更长的培养时间可能导致细菌过度生长及巨噬细胞死亡，而较短的培养时间则可能导致细菌载量显著降低。可根据需要调整MOI和感染时间以达到最佳条件。
      1. 用PBS洗涤一次感染细胞。加入20 ml预冷的无RNase水以裂解巨噬细胞。使用细胞刮刀快速但小心地将细胞从培养皿上刮下。
      2. 将裂解液收集至50 ml锥形管中。涡旋振荡30秒。在4 °C条件下以800 × g离心3分钟。
      3. 使用真空系统将上清液通过过滤装置过滤。用镊子卷起滤膜，并迅速转移至15 ml锥形管中。用液氮速冻含滤膜的管子。
      4. 按照步骤1.2.7所述，为下一个样品组装带有新滤膜的过滤装置。
      5. 将冻存的滤膜于-80 °C保存至次日。或者，可直接进行核酸提取。

表1：DNase反应方案。

RNA	最多 2 µg（最大体积 44 µl）
10x DNase 缓冲液	5 µl
无 RNase 水	加至终体积 50 µl
DNase	1 µl（1 单位）

表2：培养基与缓冲液配方。

1. 500 ml BMDM+Pen-Strep 培养基（滤膜除菌）：
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	235 ml
胎牛血清（FBS）（54 °C 灭活 30 分钟）	100 ml
巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）（L-929 条件培养基）	150 ml
谷氨酰胺	5 ml
丙酮酸钠	5 ml
β-巯基乙醇	0.5 ml
青霉素/链霉素	5 ml
总量	500 ml
2. 500 ml BMDM 培养基（滤膜除菌）：
DMEM	235 ml
FBS（54 °C 灭活 30 分钟）	100 ml
M-CSF（L-929 条件培养基）	150 ml
谷氨酰胺	5 ml
丙酮酸钠	5 ml
β-巯基乙醇	0.5 ml
总量	500 ml
3. AE 缓冲液
乙酸钠（NaOAc）pH 5.2	50 mM
乙二胺四乙酸（EDTA）	10 mM
无 RNase 水
4. 苯酚-氯仿-异戊醇（IAA）
苯酚	25 ml
氯仿	24 ml
异戊醇	1 ml
5. 氯仿-异戊醇（IAA）
氯仿	24 ml
异戊醇	1 ml

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Listeria monocytogenes 10403S
由C57B/6雌性小鼠骨髓制备的巨噬细胞
H₂O，无RNA酶	Thermo Scientific	10977-015	可使用DEPC处理的水
DMEM	Gibco	41965039
谷氨酰胺	Gibco	25030081
丙酮酸钠	Gibco	11360-088
β-巯基乙醇	Gibco	31350010
青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）	Gibco	15140-122
庆大霉素	Sigma-Aldrich	G1397
胎牛血清（FBS）	Gibco	10270106
杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS）	Sigma-Aldrich	D8537
脑心浸出液培养基（Brain heart infusion, BHI）	Merckmillipore	1104930500
乙酸钠	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
无水乙醇	Merck Millipore	1070174000
37 °C、5% CO₂ 强制通风培养箱	Thermo Scientific	Model 3111
细胞刮刀	Nunc	179693
45 mm滤膜用Kontes玻璃支架	Fisher	K953755-0045
MF-Millipore滤膜，45 mm，0.45 µm	Merck Millipore	HAWP04700
真空离心浓缩系统（SpeedVac system）	Thermo Scientific	SPD131DDA
Vortex-Genie 2涡旋振荡器	Scientific Industries	Model G560E
145 mm细胞培养皿	Greiner	639 160
1.7 ml无RNA酶离心管	Axygen	MCT-175-C
4 °C台式离心机	Eppendorf	5417R
无菌移液管，25 ml	Greiner
Falcon管，50 ml	Greiner