从RNA提取 单核细胞增生李斯特菌 从感染的小鼠巨噬细胞中收获

摘要

来源： Sigal, N., 等细胞内生长细菌的RNA纯化 单核细胞增生李斯特菌 在巨噬细胞中。 视觉实验杂志. (2016)

本视频演示了从感染的小鼠巨噬细胞中分离的单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）提取RNA的实验方法。该方案通过苯酚-氯仿和加热裂解细胞，同时保护RNA完整性，并利用离心分离RNA。在低温孵育条件下，盐和乙醇共同促进RNA沉淀。所获得的RNA可反映宿主诱导的细菌基因表达，揭示细菌的毒力机制与适应性策略。

方案

1. 核酸提取

注意：所有涉及苯酚和氯仿溶液的操作均须在通风橱中进行。

1. 为每个样品准备 400 µl 酸性酚:氯仿 1:1 混合液。在单独的离心管中混合后，通过抽吸收集所得水相层。加入 40 µl 10% SDS。
2. 将含有滤膜的离心管置于冰上解冻，以保持低温。向每个含滤膜的离心管中加入 650 µl 乙酸盐-EDTA（AE）缓冲液（50 mM NaOAc pH 5.2，10 mM EDTA，无 RNase 水）。
3. 以下步骤应尽可能快速完成。
   1. 剧烈涡旋含有滤膜的离心管，使滤膜甩至管壁边缘，并确保缓冲液充分冲洗滤膜。操作过程中应始终将离心管放回冰上以保持低温。
      注意：必要时可将离心管倒置进行额外涡旋，以彻底将细菌从滤膜上洗脱。
   2. 对所有离心管重复上述操作。操作结束后，可短暂离心（120 × g，1 分钟）以提高悬浮液的回收效率。
4. 将含有细菌的缓冲液转移至含有 SDS 和酚/氯仿混合液的 1.5 ml 微量离心管中。对所有样品重复此步骤。必要时可再次离心含滤膜的离心管（120 × g，1 分钟），以回收滤膜上残留的缓冲液。
5. 将所有 1.5 ml 离心管放入多管涡旋仪中，全速涡旋 10 分钟。
6. 将离心管置于 65 °C 恒温金属浴中孵育 10 分钟，随后在 4 °C 下以最大速度（> 14,000 × g）离心 5 分钟。
7. 将每管中的水相层（约 400 µl）转移至新的 1.5 ml 离心管中，管内预先加入 40 µl 3 M 乙酸钠（pH 5.2）和 1.0 ml 100% 乙醇。充分涡旋混匀每管。
   注意：此步骤可加入糖原以增强沉淀颗粒的可见性。
8. 将样品在 -80 °C 下孵育 1 小时；或在 -20 °C 下过夜孵育。随后在 4 °C 下以最大速度（> 14,000 × g）离心 20 分钟。
9. 小心抽吸去除每管中的乙醇（上层液体）。向每个样品中加入 500 µl 冷的 70% 乙醇，充分涡旋混匀。在 4 °C 下以最大速度（> 14,000 × g）离心 20 分钟。
10. 小心抽吸去除每管中的乙醇。使用无加热的真空浓缩仪干燥样品约 2 分钟。避免过度干燥。
11. 向每个样品中加入 25 µl 无 RNase 水。室温孵育 20 分钟。小心涡旋混匀后短暂离心。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Listeria monocytogenes 10403S
H2O，无RNA酶	Thermo Scientific	10977-015	可使用DEPC处理的水
酚，饱和，pH 4.3	Fisher	BP1751I-400
氯仿	Fisher	BP1145-1
异戊醇	Sigma-Aldrich	W205702
乙酸钠	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
10% SDS	Sigma-Aldrich	L4522
无水乙醇	Merck Millipore	1070174000
MF-Millipore滤膜，45 mm，0.45 µm	Merck Millipore	HAWP04700
Vortex-Genie 2涡旋振荡器	Scientific Industries	Model G560E
65 °C恒温金属浴	Thermo Scientific
4 °C台式离心机	Eppendorf	5417R
无菌移液管，25 ml	Greiner
Falcon管，50 ml	Greiner
1.7 ml无RNA酶离心管	Axygen	MCT-175-C
真空浓缩系统（SpeedVac）	Thermo Scientific	SPD131DDA