可视化感染小鼠膀胱中的胞内细菌群落

摘要

来源：Conover, M. S. et. al., 建立并表征小鼠模型中的尿路感染与导管相关性尿路感染。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了在感染了表达β-半乳糖苷酶的Escherichia coli的小鼠膀胱组织中检测细胞内细菌群落（IBCs）的方法。组织经固定、通透化处理并用X-gal染色后，在解剖显微镜下可见呈蓝色斑点状的IBCs，从而证实细菌在尿路感染过程中侵入了宿主细胞。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 尿路致病性 Escherichia coli (UPEC) 细菌接种物的制备

1. 制备尿路感染89（UTI89）接种物（在接种日前72小时开始）
   1. 从冻存菌种中将UTI89划线接种至LB（Luria-Bertani）琼脂平板上，于37 °C过夜培养。挑取单菌落，接种至装有10 ml LB培养基的125 ml三角瓶中，于37 °C静置培养24小时。
   2. 取10 µl过夜培养物，接种至新的125 ml三角瓶中含10 ml LB培养基的容器内，于37 °C继续静置培养24小时。
   3. 取3 ml培养物（体积可根据菌株及所需接种量调整）转移至无菌1.5 ml离心管中，在7,000 × g条件下离心3分钟，弃上清，菌体沉淀用1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，再次离心。将细菌沉淀重悬于1 ml 1× PBS中。
2. 测定细菌的光密度，并将浓度调整至所需接种浓度。常规使用的接种浓度为10⁷个细菌；但具体数值可能因实验设计而异。

2. 细菌接种

1. 使用70%乙醇清洁工作台，并铺上吸水纸（或使用无菌操作台）。
2. 将最多0.9 ml的制备好的细菌接种物吸入1 ml结核菌素（TB）注射器中（去除气泡）。将一根已灭菌、带有聚乙烯导管（规格为PE10）的接种针连接到装有接种物的注射器上，然后在无菌条件下修剪聚乙烯导管。
   注意：保留针尖上方约1 mm的导管长度，以避免刺破膀胱。
3. 剪下一寸见方的Parafilm膜，在其表面涂上一小滴外科润滑剂（约硬币大小）。
4. 将雌性C3H/HeN小鼠放入麻醉蒸发室中（按照仪器说明书操作），直至其失去意识但仍保持正常呼吸（每秒1次呼吸）。
   注意：异氟烷为吸入性麻醉剂，应在通风良好的环境中使用，并尽量减少吸入。
5. 将小鼠从蒸发室中取出，仰卧于纸巾上，并将其双腿分开。
6. 用鼻罩（连接至蒸发室、可提供可控异氟烷剂量的管道，部分蒸发室设备配备此装置）覆盖小鼠鼻部，以维持麻醉状态。
7. 轻柔按压膀胱以诱导排尿，确保膀胱排空。用100%乙醇擦拭纸巾擦拭尿道周围区域。将接种针/注射器的针尖部分轻轻蘸入外科润滑剂中。
8. 通过经尿道插入接种针约12 mm，向每只小鼠接种50 µl细菌溶液，并轻压注射器推杆，以10 µl/sec的速度将接种物注入膀胱。接种完成后，将接种针从小鼠体内取出。
   注意：开始接种时若立即在尿道口观察到接种物流出，提示接种针插入不当或未完全插入。
9. 将小鼠从鼻罩中取出并放回笼中。对每只小鼠重复步骤2.3–2.8。当更换接种物条件或菌株时，应将注射器和接种针丢弃至经批准的锐器容器中，并从步骤2.2重新开始。 
   注意：使用尿路致病菌接种通常不会引起严重疼痛症状。然而在极少数情况下，给予高剂量病原体可能导致发热、摄食和饮水减少以及异常行为。实验期间应持续监测动物健康状况。若观察到明显疼痛症状，可给予镇痛药，如皮下注射布托啡诺（Buprenorphine，0.05−0.1 mg/kg）。

3. 胞内细菌群落（IBC）的计数

1. 无菌取出膀胱，并将其置于含硅胶底的6孔板中的1×PBS中。可通过硅胶弹性体试剂盒制备板子，向每孔倒入约1 cm厚的硅胶。用剪刀将膀胱剪成两半。
2. 使用小型金属针轻轻将膀胱展开，使膀胱腔面朝上。务必把针固定在膀胱组织的最外缘，以确保最大程度暴露尿路上皮。
3. 展开后，用1×PBS轻轻冲洗膀胱一次，然后用移液器吸除1×PBS。加入足量3%多聚甲醛，完全覆盖展开的膀胱进行固定。 
   注意： 多聚甲醛具有致癌性，操作时必须始终佩戴适当防护装备，包括手套。废弃物处置应遵循所在机构的相关规定。
4. 室温孵育1小时，移除多聚甲醛溶液，用1×PBS洗涤一次。
5. 用LacZ洗涤液（含2 mM MgCl₂、0.01%脱氧胆酸钠和0.02% Nonidet-P40的1×PBS）洗涤三次，每次5分钟。
6. 移除洗涤液，加入足量LacZ染色液（9.5 ml LacZ洗涤液、0.4 ml 25 mg/ml X-gal、0.1 ml 100 mM 铁氰化钾/亚铁氰化钾），完全覆盖膀胱组织。避光，30 °C过夜孵育。
7. 从孵箱中取出展开的膀胱，使用体视显微镜在40–60倍放大下观察，可见呈蓝色点状的胞内细菌群落（IBC）。
   注意： 有时小鼠在尿道下方导管放置前可能已排尿。此时，应等待15–20分钟后再尝试再次收集尿液。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
感染实验材料：
异氟烷 – Isothesia	Butler Schein	29405	250 ml
透明直壁玻璃罐	Kimble Chase	5413289V 21
不锈钢茶叶过滤器	Schefs-Amazon		Schefs 品牌优质大容量不锈钢散装茶叶过滤器
非无菌棉球	Fisherbrand	22-456-880
50 ml Falcon 管	VWR	89039-660
Isotec 3 - 蒸发器	Ohmeda	1224478
耳标钳	Fisher Scientific	13-812-201	（必要时使用）
聚维酮碘溶液	Betadine solution		10% 聚维酮碘外用溶液
棉签	Fisher Scientific	22-037-924	6 英寸
实验台用吸水垫	Fisherbrand	14206 63	吸水性垫单（20 英寸 × 36 英寸）
外科润滑剂	Surgilube	0281-0205-36
解剖剪刀	Fine Science Tools, INC	14084-08
显微有齿镊	Fine Science Tools, INC	11018-12
1 ml 注射器	BD	309659	结核菌素滑动针头
Parafilm 封口膜	Bemis	PM996	4 英寸 × 125 英尺
Eppendorf 管架	Fisherbrand	05-541-1
Eppendorf 管	MIDSCI	AVX-T-17-C
IBC 实验材料：
6 孔组织培养板	Techno Plastic Products	92006
固定针	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	硅橡胶弹性体试剂盒
X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷）	Invitrogen	15520-034	超纯级
N,N-二甲基甲酰胺	Sigma Aldrich	D4551
氯化镁	Sigma Aldrich	M8266
脱氧胆酸钠	Sigma Aldrich	D6750
Nonidet-P40	Roche	11754599001	辛基酚聚氧乙烯醚
六氰合铁(II)酸钾三水合物（亚铁氰化钾）	Sigma Aldrich	P3289
六氰合铁(III)酸钾（铁氰化钾）	Sigma Aldrich	60299