Agrobacterium介导的重组病毒克隆递送至玉米幼苗以实现基因沉默

摘要

来源：Beernink, B. M. et al. 利用重组狗尾草花叶病毒和甘蔗花叶病毒侵染性克隆注射法直接进行玉米幼苗农杆菌接种。J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了 农杆菌介导的重组病毒克隆递送至玉米幼苗以实现基因沉默。该方法概述了以下流程： 农杆菌 感染、系统性病毒扩散以及RNA干扰介导的表型变化

方案

1. 注射
注意：可使用4至7天大的玉米幼苗进行注射。幼苗生长速度受多种因素影响，包括生长条件、光合有效辐射（PAR）量（例如，温室中的PAR高于人工气候室）以及基因型等，其中许多因素在温室条件下难以控制。幼苗在4天大时即可进行注射，此时植株高度为2-3 cm，尚无展开的叶片；最晚可在7天大时注射，此时最下部的圆尖叶片已展开。播种超过7天后，该接种方法的成功率会迅速下降。无论幼苗年龄如何，注射位点均相同。

1. 佩戴安全护目镜，使用连接在1 mL一次性注射器上的25G × 5/8"针头，将细菌悬浮液注入到芽鞘节上方2-3 mm处。
   注意：芽鞘节是将来冠根形成的位置，为植株上最下方的节。通常在此节及其下方会出现从绿色到白色的色泽变化。注射位置位于分生组织正上方。在此阶段解剖几株幼苗有助于观察分生组织的位置，从而确定正确的注射位点。
2. 轻柔推动注射器，使悬浮液充满芽鞘或在叶鞘 whorl 中可见，具体取决于植株的生长阶段。注射量约为100–200 µL。
   注意：若难以将悬浮液注入幼苗，可能是注射位置过低。只需施加适中压力即可完成注射。
3. 对所有幼苗进行注射，每种构建体需更换新的注射器和针头。

2. 植物的持续养护

1. 在幼苗7-8天大时，将其移栽至13 x 13 x 15 cm或更大的花盆中。
2. 保持生长条件（16小时光周期，每周施肥一次）。

3. 感染的确认（表型方法）

1. 在接种后14至21天（DPI）对植株进行表型评分。沉默对照基因lesion mimic 22或phytoene desaturase后，叶片上出现的病斑清晰可见，且与FoMV症状明显不同。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	Fisher Scientific	14955450	也可使用 BD 309659
农杆菌 GV3101 菌株			携带编码T-DNA转移机制的vir质粒，利福平抗性（RifR），庆大霉素抗性（GmR），来自实验室保藏
肥料			Peters 肥料 15-15-15 浓缩液
大号花盆	Kordlok	SQL0550	5×5×4 英寸或更大，用于移栽幼苗
玉米‘金斑马’甜玉米种子	American Meadows, West Coast Seeds
土壤基质	SunGro 园艺公司	SS#1-F1P	Sunshine Mix #1/Fafard-1P，任何适合玉米生长的土壤混合物均可