建立用于研究口腔致病机制的细菌–真菌跨域生物膜

摘要

来源：Schlafer, S, 和 Frost Kristensen, M. 利用共聚焦显微镜监测跨界生物膜中的细胞外 pH 值。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了在模拟口腔环境条件下，对Streptococcus mutans和Candida albicans跨域生物膜的培养，以建立细菌–真菌相互作用模型，从而研究微生物协同效应、葡聚糖介导的黏附以及口腔致病过程中的产酸性毒力。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 跨界生物膜的培养

1. 培养 变异链球菌（S. mutans） DSM 20523 和 白色念珠菌（C. albicans） NCPF 3179 在37 °C、有氧条件下于血琼脂平板上培养。
2. 将每种生物的单个菌落转移至装有5 mL脑心浸液（BHI）的试管中，在37 °C有氧条件下培养18 h。
3. 将过夜培养物在 1,200 x g 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于生理盐水中，并调整 OD_{550 纳米米} 至 0.5 C. albicans (~10⁷ 细胞/毫升）和 S. mutans (~10⁸ 细胞/毫升）。稀释 S. mutans 1:10 悬液，使用无菌生理盐水 (~10⁷ 细胞/毫升
4. 将50 µL无菌唾液溶液加入用于显微镜观察的光学底96孔板的各孔中，37 °C孵育30分钟。用100 µL无菌生理盐水洗涤各孔3次。弃去孔内液体。
5. 加入 100 µL 的 C. albicans 向每孔中加入悬浮液。37 °C孵育90分钟。用无菌生理盐水洗涤3次。
   注意： 洗涤过程中切勿将孔完全排空，保留20 µL的残留液体，以避免产生过大的剪切力。
6. 每孔加入 100 µL 经热灭活的胎牛血清（56 °C 灭活 30 分钟）。37 °C 孵育 2 小时。用无菌生理盐水洗板 3 次。弃去液体，每孔保留 20 µL 储液。
7. 加入 100 µL 的 S. mutans 将悬液（步骤1.3中制备）加入各孔中，每孔加入含5%蔗糖的BHI培养基150 µL。37 °C孵育24小时或更长时间。培养较老的生物膜时，每日更换新鲜BHI培养基。在跨域生物膜生长阶段结束时，用无菌生理盐水洗涤5次。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
血琼脂平板	Statens Serum Institut	677
脑心浸液培养基	Oxoid	CM1135
含5%蔗糖的脑心浸液培养基	BDH laboratory supplies	10274
Candida albicans	国家病原真菌保藏中心	NCPF 3179
胎牛血清	Gibco Life technologies	10270
GS-6R 冷冻离心机	Beckman	N/A
96孔黑色微孔板（µ-Plate）	Ibidi	89626
无菌生理盐水	VWR	6404
Streptococcus mutans	德国微生物与细胞培养物保藏中心	DSM 20523
Vis-分光光度计 V-3000PC	VWR	N/A