一种用于生物膜形成过程中实时成像与压力追踪的微流控装置

摘要

来源：Kurz, D. L., 等。用于研究多孔介质中生物堵塞的微流控平台。J. Vis. Exp. (2022)

该视频展示了利用微流控装置研究生物膜形成的过程。将细菌悬液引入微通道中，随后进行孵育以促进生物膜的发育。然后恢复流体流动，通过压力监测结合成像技术，随时间检测生物膜的形成及孔道堵塞情况。

方案

1. 硅片制备

1. 使用计算机辅助设计（CAD；参见材料表）软件设计微流控通道的几何结构，并将其打印到透明胶片上以制作光掩膜（图1A）。
2. 通过软光刻技术（在洁净室条件下）按照以下步骤制备主模具。
   1. 将硅片在200 °C下烘烤2小时。
   2. 将硅片置于匀胶机中心，倒入SU8 3050光刻胶（参见材料表），以1,700 rpm的转速旋涂40秒，斜坡时间设置为10秒/100 rpm。
      注意：旋涂参数设定旨在使SU8 3050达到目标厚度100 µm。
   3. 旋涂完成后，在65 °C下预烘600秒，在95 °C下烘烤2,700秒。随后将硅片在室温下冷却过夜。
      注意：过夜冷却有助于增强SU8与硅片之间的粘附性。
   4. 将光掩膜（步骤1.1）放置在硅片上，并用波长为350 nm、曝光能量为250 mJ/cm²的紫外光进行曝光。
   5. 曝光后，将曝光后的基底在65 °C下烘烤60秒，在95 °C下烘烤300秒。
   6. 通过将硅片浸入装有mrDev600显影液（参见材料表）的烧杯中进行显影。轻轻摇动烧杯1,800秒以洗去未聚合的光刻胶，然后用异丙醇喷洒冲洗硅片并用空气吹干。
   7. 将硅片在200 °C下高温烘烤1,800秒。
3. 将20 µL的三氯（1H,1H,2H,2H-全氟辛基）硅烷（参见材料表）滴加在靠近模具的玻璃载片上，在真空干燥器中进行硅烷化处理40分钟，维持表压为100 mbar。

2. 微流控装置的制备

注意： 此处描述的制造流程适用于含有一条微流控通道的微流控装置。然而，相同的方法也可用于并行制造具有多条微流控通道的微流控装置。

1. 按照10:1的比例将弹性体与其交联剂混合（参见材料表），制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合物。持续搅拌混合物，直至其均匀混合，并因夹带的气泡而呈现不透明状。
2. 将混合物置于真空干燥器中脱气，使表压达到100 mbar，直至去除夹带的气泡，混合物变为透明。脱气过程通常需要30 min。
3. 将母模（步骤1）放入细胞培养皿中（参见材料表）。在母模上倒入20 g PDMS混合物，以形成最终厚度为5 mm的通道。
4. 在70 °C下烘烤母模2 h。
5. 使用刀片在固化后的PDMS上沿微流控通道周围（距离通道约3 mm处）进行切割，然后将PDMS微流控通道从母模上剥离下来。
6. 为创建微流控通道的入口和出口，使用穿孔活检针（直径1.5 mm）在通道两端（三角形顶端，参见图1A）打孔。在入口端三角形中心额外打一个孔，以便后续安装压力传感器。
7. 用市售的1%洗涤剂溶液（参见材料表）清洗载玻片和微流控通道5 min，然后用去离子水冲洗。接着，用异丙醇清洗PDMS微流控通道和载玻片，再用去离子水再次冲洗。最后，用1 bar的压缩空气吹干PDMS微流控通道和载玻片，持续1 min。
   注意： PDMS的多孔结构必须完全干燥，以确保键合效果。
8. 将载玻片和微流控通道放入等离子清洗机中（参见材料表），确保待键合的表面朝上。开启等离子清洗机，以1 SL/h（标准升每小时）的气流条件使用空气等离子体处理微流控通道和载玻片1 min。取出后立即将其相互贴合，完成微流控通道与载玻片的键合。
   注意： 切勿触碰已处理的表面，以免影响键合效果。当制备包含多个微流控通道的微流控装置时，应同时暴露所有通道，并一次性完成键合。
9. 将键合完成的微流控装置置于80 °C的加热板上，至少放置15 min。
10. 将微流控装置存放于洁净的细胞培养皿中，直至实验开始。

3. 细菌悬液的制备

1. 实验开始前20小时，从冷冻甘油菌种中直接接种3 mL营养肉汤第3号培养基（见材料表）至15 mL培养管中，用于培养Bacillus subtilis NCIB 3610菌群。在30 °C、200 rpm条件下，于摇床培养箱中过夜培养16小时。
2. 实验开始前4小时，取上述过夜培养物进行传代培养：在15 mL培养管中，将3 µL过夜培养物加入3 mL新鲜培养基中（1:1,000稀释）。在30 °C、200 rpm的摇床培养箱中培养3.5–4小时，使600 nm处的光密度（OD₆₀₀）达到0.1。

4. 生物膜生长实验

1. 实验前3小时打开显微镜的培养箱，以确保温度稳定在25 °C。安装注射泵和压力传感器（见材料表）。
2. 将进样和出样管路连接至微流控装置。将一根外径为0.6 mm的针头直接插入进样管路，以固定管路与注射器之间的连接。
3. 将微流控装置、30 mL去离子水和30 mL培养基放入真空干燥器中，脱气至少1小时。然后缓慢将培养基和去离子水分别吸入两个30 mL注射器中。
   注意：此步骤至关重要，可防止用培养基冲洗时通道内产生气泡。
4. 将微流控装置安装在显微镜上，并将出样管路置于废液容器中。
   1. 通过微流控管路将装有去离子水的注射器连接至微流控通道，缓慢注入水直至从压力传感器出口流出。用水填充压力传感器，并冲洗连接微流控通道与压力传感器的管路中的所有气泡。使用专用于压力传感器的螺丝封闭压力传感器的出口。
      注意：上述填充程序可确保微流控通道入口处的压力变化被精确记录。当进行多个微流控通道的实验时，应将每个通道连接至独立的注射器，以确保所有通道内的流动条件一致。
5. 用去离子水填充其余的微流控通道。
6. 在培养基注射器上安装1.2 µm滤膜（见材料表）。然后取下水相注射器，小心地将培养基注射器连接至进样微流控管路。将注射器安装在注射泵上，并以2 mL/h的流速用培养基冲洗通道1小时。
   注意：该滤膜可防止细菌细胞在装载过程中进入注射器。用培养基冲洗微流控通道可去除多孔结构中残留的气泡。
7. 实验期间将注射泵设定至所需流速（此处为1 mL/h），并将压力传感器的压力读数归零。
   注意：通过将初始压力读数设为零，仅测量实验过程中生物膜发育引起的压力变化。
8. 取1 mL OD₆₀₀为0.1的细菌培养液加入1.5 mL离心管中。将出样管插入离心管，将细菌培养液加载至微流控通道。等待5分钟以排除管路出口可能存在的气泡后，以1 mL/h的流速回抽150 µL细菌溶液，直至微流控通道完全充满细菌培养液。
9. 小心移除培养基注射器上的滤膜，并将出口置于废液容器中。让细菌细胞在微流控通道中处于无流动条件下静置3小时，以使其在多孔介质表面附着。
   注意：将细菌细胞在无流动条件下静置3小时的条件已针对所用菌株的附着进行优化，同时保证细菌培养处于良好供氧状态。其他细菌菌株可能需要更长或更短的时间。
10. 开始实验时，将注射泵设定至所需流速（此处为1 mL/h）以启动流动，并以1 Hz频率开始记录压力数据。
11. 以所需的时间间隔、光学配置和放大倍数采集生物膜生长的图像。​
    注意：在本研究中，每隔6分钟在明场模式下以4倍放大倍数采集多孔介质整个区域范围内18个位置的图像，持续24小时。

结果

图1：微流控通道设计与实验装置。 （A）微流控通道的光刻掩模，通道内含有不同孔径（75 µm、150 µm 和 300 µm）的结构，用作多孔介质的模拟，并显示柱状结构排列的放大视图（底行）。圆圈标示了柱状结构（不可渗透障碍物）的位置，代表多孔介质的固相。（B）实验装置示意图，显示了注射器、压力传感器、微流控装置（含单个微流控通道）以及配备物镜（即显微镜）的数码相机系统。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Acrodisc 25 mm 注射器滤器，1.2 µm Versapor 膜	Pall Corporation	PN4190	1.2 µm 滤器
BD 10 mL 注射器（鲁尔锁）	BD	300912	用于以去离子水填充通道
培养箱	Life Imaging Services		用于在生物膜生长实验期间维持稳定温度
细胞密度计 CO8000	WPA biowave		OD 测定仪
离心管	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		注射泵
CorelCAD	CorelDRAW		用于设计微流控通道几何结构的软件
培养管（14 mL，无菌）	greiner bio-one		培养管
干燥烘箱，VENTI-Line	VWR		用于固化 PDMS
Handy	Migros		洗涤剂溶液
带温度控制的加热板	VRW		用于等离子处理后固化 PDMS-玻璃键合
Innova 42 Inc 摇床（New Brunswick）	Eppendorf		培养箱
异丙醇（> 99.8%）	Sigma Aldrich	67-63-0
Masterflex 转移软管	Masterflex	HV-06419-05	内径 0.020''，外径 0.06''
载玻片，平片，75 x 60 mm	Corning	2947-75X50	玻璃载玻片
微流控压力传感器（1 bar）	Elveflow		压力传感器
Miltex 活检打孔器，直径 1.5 mm	Integra		用于制作微流控通道的进样口和出样口孔洞
mrDev600 显影液	Microresist
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		显微镜
营养肉汤 n°3	Sigma Aldrich
Omnifix 带鲁尔锁的注射器	B.Braun		不同体积的注射器
等离子腔体 Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	用于将 PDMS 与玻璃载玻片进行等离子键合
精密擦拭纸（Kimtech Science）	Kimberly Clark	KCP-7552	用于干燥玻璃载玻片
天平	VWR-CH	611-2605	用于称量弹性体与交联剂的比例
硅晶圆（10 cm）	Silicon Materials Inc.		N//Phos <100> 1-10 Ω cm
匀胶机，Spin 模块 SM150	Sawatec
SU8 3050 光刻胶	Kayakuam
Süss MA6 掩模对准器	SUSS MicroTec Group		用于对准铬-玻璃掩模
Sylgard 184	Dow Corning		硅酮弹性体套件；固化剂
Techni Etch Cr01	Technic		Technic
组织培养皿 150	TPP	93150
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷	Sigma Aldrich	Sigma Aldrich	用于硅烷化硅晶圆
Veeco Dektak 6 M	Veeco		轮廓仪