一种用于生物膜形成过程中实时成像和压力追踪的微流控装置

摘要

来源： Kurz， D. L. 等人。 微流控平台用于研究多孔介质中的生物堵塞。 J. Vis. Exp. （2022年）

视频演示了使用微流控装置研究生物膜形成的方法。细菌悬浮液被引入微通道，随后培养以促进生物膜的形成。随后恢复流动，利用压力监测和成像监测，随时间检测生物膜形成和孔隙堵塞。

方案

1. 硅晶圆制备

1. 在计算机辅助设计（CAD;参见 材料表）软件中设计微流控通道的几何形状，并将其打印到透明薄膜上以制作光罩（见图1A）。
2. 按照以下步骤，在无雪室条件下通过软光刻法制造主模具。
   1. 将硅晶圆烘烤在200°C，烘烤2小时。
   2. 将晶圆置于离心涂层机中心，并向晶圆倒入SU8 3050光刻胶（见 材料表）。在1700转/分钟时喷涂40秒，加速时间为10秒/100转/分钟。
      注意： 自旋涂层参数设定为SU8 3050的目标厚度为100微米。
   3. 离心涂层后，将硅晶圆软烘烤在65°C下600秒，95°C软烘烤2700秒。让硅片在室温下冷却一夜。
      注意： 夜间冷却增强了SU8与晶圆的附着力。
   4. 将光罩（步骤1.1）放置在晶圆上，并以250 mJ/cm²的曝光能量、波长350 nm的紫外线照射。
   5. 曝光后，将裸露基底在65°C烘烤60秒，95°C烘烤300秒。
   6. 通过浸泡在装有mrDev600显影剂的烧杯中，显影硅片以获得主模具（见 材料表）。轻轻摇晃烧杯1800秒，洗净未聚合的光阻。然后，喷洒异丙醇在硅片上进行溅洗，然后自然风干。
   7. 在200°C下硬烘烤硅片1800秒。
3. 通过将20微升三氯硅烷（1H、1H、2H-全氟乙酰）硅烷（见 材料表）气相沉积，置于模具旁的玻璃载玻片上，在真空干燥器中蒸馏40分钟，形成100毫巴的压力。

2. 微流控器件的制造

注意： 这里描述的制造工艺是针对一个微流控通道的微流控器件。然而，同样的方法也可以应用于制造具有多个微流控通道并行的微流控器件。

1. 将弹性体与交联剂以10：1的比例混合（见 材料表），制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合物。搅拌混合物直到均匀混合，并因密封气泡而变得不透明。
2. 在真空干燥器中对混合物进行脱气，产生100毫巴的压力，直到被困的气泡被清除，使其看起来透明。脱气通常需要30分钟。
3. 将主模具（步骤1）放入细胞培养皿中（见 材料表）。将20克PDMS混合物倒入主模上，制成最终厚度为5毫米的槽。
4. 将主模具烘烤2小时，温度为70°C。
5. 用刀片在微流控通道周围切割固化后的PDMS（约3毫米距离），然后将PDMS微流控通道从主模具上剥离。
6. 为了形成微流控通道的进出口，需在其末端（三角形顶部，见 图1A）用直径1.5毫米的活检冲孔器打孔。在进气三角中心再打一个孔，以便之后安装压力传感器。
7. 用市售的1%洗涤剂溶液（见 材料表）清洗玻璃玻片和微流控通道5分钟，然后用去离子水冲洗。之后，用异丙醇清洗PDMS微流控通道和玻片。然后用去离子水再次冲洗。用压缩空气在1巴下干燥PDMS微流控通道和玻璃滑套，持续1分钟。
   注意： PDMS的多孔结构必须完全干燥，才能有效结合。
8. 将玻片和微流控通道放入等离子体清洗器中（见 材料表），并确保待粘结的表面朝上。打开等离子清洗机，用空气等离子体以1 SL/h（标准升每小时）气流处理微流控通道和玻璃滑片，持续1分钟。取出玻璃片后，立即将微流控通道与玻片接触连接。
   注意： 确保不要触摸处理过的表面，因为这可能会影响粘合。在制造具有多个微流控通道的微流控器件时，应同时暴露微流控通道并在一步内将其结合。
9. 将粘接的微流控装置放置在80°C的热板上，至少加热15分钟。
10. 将微流控装置存放在干净的细胞培养皿中，直到实验开始。

3. 细菌悬浮液的制备

1. 在实验开始前，通过直接从冷冻甘油液中接种3毫升营养液3号培养基（见材料表）在15毫升培养管中，培养20小时内的Bacillus subtilis NCIB 3610种群。在摇晃培养箱中，30°C、200转/分钟，过夜孵育16小时。
2. 在实验开始前4小时，将3微升过夜培养液加入3毫升新鲜培养基（1：1,000稀释）中，并置于15毫升培养管中，从隔夜培养中进行亚培养。在30°C、200转/分钟的摇晃培养箱中孵育亚培养3.5-4小时，获得600纳米（OD₆₀₀）波长0.1的光学密度。

4. 生物膜生长实验

1. 实验前3小时打开显微镜箱式孵化器，确保温度稳定在25°C。安装注射器泵和压力传感器（见 材料表）。
2. 将进出口管连接到微流控装置。直接将一根外径0.6毫米的针插入入口管，以固定管子与注射器的连接。
3. 将微流控装置、30毫升去离子水和30毫升培养基放入真空干燥器中，进行至少1小时的脱气。然后，慢慢将培养液和去离子水分别放入两个30毫升注射器中。
   注意： 这一步对于防止在与培养基冲洗时通道内形成气泡至关重要。
4. 将微流控装置安装在显微镜上，并将出口管放入废物容器中。
   1. 将装满去离子水的注射器连接到微流控通道，通过微流控管路，缓慢注入水直到水从压力传感器出口流出。将压力传感器注满水，冲洗连接微流控通道和压力传感器的管道中的所有气泡。用专用螺丝关闭压力传感器的出口。
      注意： 上述填充程序确保微流控通道入口处的压力变化被精确记录。在运行多个微流控通道的实验时，将每个通道连接到独立的注射器，以确保所有通道的流量条件均等。
5. 用去离子水填充剩余的微流控通道。
6. 在培养基注射器上放置一个1.2微米过滤器（见 材料表）。然后，取出水注射器，小心地将培养基注射器连接到入口微流控管。将注射器安装在注射器泵上，并以2 mL/h的流量冲洗通道，持续1小时。
   注意： 过滤器在装注时防止细菌进入注射器。用培养基冲洗微流控通道可以去除多孔结构中剩余的气泡。
7. 在实验过程中将注射器泵设置为所需的流量（此处为1 mL/h），并将压力传感器的压力读数设为零。
   注意： 将初始压力读数设为零，仅测量实验中生物膜形成引起的压力差。
8. 将1毫升细菌培养液以0.1的OD₆₀₀移入1.5毫升离心小瓶。将细菌培养物装入微流控通道，将出口管放入离心机小瓶中。等待5分钟清除管子出口可能存在的气泡后，以1 mL/h的流量抽取150微升细菌溶液，直到微流控通道被细菌培养物填满。
9. 小心取下培养基注射器过滤器，将出口放入废物容器。将细菌细胞置于微流控通道中零流状态3小时，以便其表面附着于多孔介质中。
   注意： 将细菌细胞置于零流量状态下3小时，以优化细菌菌株的附着，同时保证细菌培养物高度含氧。其他菌株可能需要更多或更短的时间。
10. 开始实验时，将注射器泵设置为所需的流量（此处为1 mL/h），并以1 Hz开始读数压力。
11. 在所需的时间间隔、光学构型和放大倍率下获取生长中的生物膜图像。​
    注意： 本研究中，每6分钟拍摄一次4倍放大率、明场模式、18个位置、覆盖整个多孔介质域的图像，持续24小时。

结果

图1：微流控通道设计与实验装置。 （A）不同孔径（75微米、150微米和300微米）微流控通道的光罩，作为多孔介质模拟，以及柱子排列的放大视图（下排）。圆圈显示柱子（不透水障碍物）的位置，代表多孔介质的固相。（B）实验装置示意图，显示注射器、压力传感器、微流控装置（仅有微流控通道）及数码相机装置及物镜（即显微镜）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Acrodisc 25毫米注射器滤芯，1.2微米Versapor膜	帕尔公司	PN4190	1.2微米滤波器
BD 10毫升注射器（Luer-Lock）	BD	300912	用于用去离子水填充通道
箱子孵化器	生命影像服务		在生物膜生长实验中保持稳定温度
细胞密度计CO8000	WPA生物波		OD表
离心瓶	埃彭多夫	30120086	1.5毫升
CETONI 基地120	CETONI 有限公司		注射器泵
CorelCAD	CorelDRAW		用于设计微流控通道几何形状的软件
培养管（14毫升，无菌）	格赖纳生物一号		培养管
烘干烤箱，VENTI-Line	VWR		用烤箱固化PDMS
方便	米格罗斯		洗涤剂溶液
带温控的热板	VRW		等离子体处理后，PDMS-玻璃键合的固化
Innova 42 Inc 摇床（新不伦瑞克省）	埃彭多夫		孵化器
异丙醇（> 99.8%）	西格玛·奥尔德里奇	67-63-0
Masterflex转移管	Masterflex	HV-06419-05	0.020英寸内径，0.06英寸外径
微型幻灯片，普通，75 x 60毫米	科宁	2947-75X50	玻璃幻灯片
微流控压力传感器（1巴）	精灵流		压力传感器
Miltex活检穿孔器，直径1.5毫米	英特格拉		冲孔器用于开凿微流控通道的进出口孔
mrDev600 开发者	微光刻胶
尼康Eclipse Ti2	尼康仪器		显微镜
营养汤第3号	西格玛·奥尔德里奇
带Luer-Lock的Omnifix注射器	B·布劳恩		不同容量的注射器
等离子体室Zepto	迪纳电子	ZEPTO-1	用于等离子键合PDMS和玻片
精准擦拭（Kimtech Science）	金伯利·克拉克	KCP-7552	用来干燥玻片
比例	VWR-CH	611-2605	用于称量弹性体与交联剂的比例
硅晶圆（10厘米）	硅材料公司		N//Phos <100> 1-10 Ω 厘米
旋涂机，旋转模块 SM150	萨瓦特克
SU8 3050 光刻胶	卡亚库姆
Süss MA6 掩膜对准器	SUSS MicroTec 集团		用于校正镀铬玻璃面罩
西尔加德 184	道康宁		硅胶弹性体套件;固化剂
Techni 蚀刻 CR01	技术		技术
组织培养皿150	跨太平洋伙伴关系协定（TPP）	93150
三氯（1H、1H、2H、2H 全氟乙基）硅烷	西格玛·奥尔德里奇	西格玛·奥尔德里奇	用于硅化硅化硅片
Veeco Dektak 6 M	维科		轮廓仪