基于显微镜的细菌附着于植物根部表面的评估

摘要

来源： Matthysse， A. G. 实验室测量细菌对植物表面的附着情况。 J. Vis. Exp. （2018年）。

本视频演示了利用相差显微镜评估细菌与植物根部的附着情况。首先将与细菌孵育的幼苗根样本装裱，以检查游离细菌。随后对样本进行清洗以去除松散附着的细菌，并用合适的盖片重新装配以防止损坏。最后，在显微镜下计数附着在根毛上的细菌数量。

方案

1. 细菌接种

1. 根据用于确定细菌粘附力和潜伏时间的测量数据，确定需要接种的细菌数量。
2. 对于培养时间少于1天的显微研究，应接种较多数量的细菌。加入一定量的培养物，使最终细菌浓度超过每毫升10.6个。如果要延长潜伏时间，可以减少细菌接种量。
3. 对于通过可活细胞计数测量细菌粘附的研究，添加一定量培养物，使最终细菌浓度达到每毫升103^至106^个。
4. 避免添加过多细菌，以致其代谢改变培养基中的pH或氧浓度。用pH纸或电极测量pH值。用氧电极测量氧气浓度。
5. 对于沙中生长的植物，有三种可能的接种方式。
   1. 种植前，将种子浸泡在约每毫升10至⁶ 个细菌的水中浸泡1分钟，先将细菌接种。
   2. 通过发芽轴系幼苗为根部进行接种。当幼苗根长约1厘米时，浸入或将整株幼苗置于每毫升10至⁶ 个细菌的悬浮水中，浸泡1分钟。
   3. 种植前将细菌与沙子混合，使沙子最终浓度约为每毫升^10.3个细菌，或在种植后用10.6个细菌的悬浮液浇水给幼苗。

2. 细菌与植物材料的培养

1. 液体培养基中，应将细菌与植物材料一起在无菌水中、蔗糖和矿物盐或植物组织培养基（如1：10稀释的Murashige和Skoog基底盐混合物或MS盐）中孵育。
   1. 使用细菌不附着的容器。尽量持续覆盖植物表面，无论是浸水还是轻轻搅拌。剧烈搅拌可能阻止附着，甚至清除植物表面的细菌。
   2. 在不同时间间隔后用光学显微镜观察植物材料，以确定何时停止孵化并进行测量。粘附时间通常很有价值，样本可每1到4小时或每天采集一次，具体取决于相互作用速度。
2. 在沙中孵育时，应用步骤2.1中液体培养基中描述的相同注意点。

3. 利用显微镜测量粘附力

1. 使用Nomarski或相位对比光学进行显微测量，以便方便观察表面上的细菌。然而，任何放大倍数达到20倍或更高的明场显微镜都可以使用。
   1. 利用显微镜观察来判断细菌是随机分布还是分布在特定部位。另外，检查它们是单独绑定还是成簇绑定。观察是否有微菌落，表明粘连后细菌生长或被困。检查细菌表面是否形成生物膜。
      注意：生物膜是大量细菌结合在表面，并被细胞外基质包围。结构可以是平滑均匀的，也可以是更复杂的结构。
   2. 使用带有荧光标记的细菌。如果存在其他细菌，并且通过荧光标记（如绿色荧光蛋白GFP）识别出感兴趣的细菌，使用荧光显微镜确定标记细菌是否在其他细菌群中存在。对于GFP，使用激发490 nm、发射520 nm的滤光片。
      1. 通过观察同一菌株野生型细菌和标记细菌的等比例混合，使用Nomarski和荧光光学，检查荧光标签是否对细菌产生不良影响。如果荧光菌和暗色菌随机混合且数量相等，则标签未干扰检测结果。
2. 确定附着细菌的数量。
   注意：在显微镜中确定附着细菌的数量非常困难。当结合作用于不规则的植株表面时，通常无法获得定量测量。扫描电子显微镜（本文未讨论）可用于进行此类测量。
   1. 当细菌被结合在光滑表面（如根毛）时，按根毛长度毫米计算与根毛边缘结合的细菌数量。比较测量时，请注意使用大小和形状大致相同的根毛。
   2. 要确定显微镜中物体的大小，可以使用带有测量标记的商用载玻片。在与实验材料相同的设置下观察并拍摄这张玻片，并利用所得图像确定显微照片中物体的大小。
3. 准备显微镜检查样品。
   1. 洗样品。将样品移至显微镜载玻片上的一滴水或培养基上，直接观察。
      注意：这样做的优点是，如果没有细菌生长或实际的细菌死亡，游离细菌的可能性不大。游离细菌的缺失可以作为细菌死亡或细菌与培养容器结合的警示信号。洗涤样品的效果如 图1所示。
   2. 将样品放入液体小瓶中，轻轻倒置样品，用水或培养基轻轻清洗。然后将样品放入显微镜载玻片中，浸泡在新鲜液体中进行观察。
   3. 使用普通盖片和显微镜载玻片将样品装在液体中。
      1. 如果样品较厚，会导致盖片下方隆起，使用压贴盖片。这些套边缘有一圈橡胶或塑料环。将液体和样品放入盖片的井中，然后将载玻片放在上面，轻轻按压以密封盖片与载玻片。倒转并检查。
      2. 或者，也可以用藻类计数载玻片和覆盖套，类似方式。请注意，这种深度的幻灯片通常不能用放大倍数超过20倍的物镜进行检查。

结果

图1：样品准备步骤，用于确定结合细菌数量。 农杆菌tumefaciens 能结合番茄根毛（A、B和C）以及尼龙丝（D、E和F）。在未洗涤的水中样品中，可以同时看到结合细菌（黑色箭头）和游离细菌（白色箭头）（A和D）。清洗后，结合的细菌依然存在，但游离细菌（B和E）已不存在。超声波处理后，结合的细菌从样品表面（C和F）中移除。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
光学显微镜	任何	无	相位对比或Nomarski光学很有帮助，使用荧光标记的研究则需要荧光显微镜。
种子	任何	无	记下种子批号和品种
漂白剂	任何	无
巴斯超声器	任何科学供应公司	无
特里顿 X-100	西格玛-奥尔德里奇	T9284
营养琼脂	迪夫科	2001-01-08
大豆石	迪夫科	24360
沙子	海沙 费舍尔科学	S25
沙子	西格玛-奥尔德里奇	S9887
集装箱	斯图威与子公司	雷-利奇锥-封闭器	市面上有许多不同尺寸的植物可供选择，适合你想种植的植物类型
副胶片	任何科学供应公司	无
MS盐	西格玛-奥尔德里奇	M5524
塞奇威克椽子计数单元	豪泽科学	HS3800
探针夹压封孵化箱	西格玛-奥尔德里奇	Z359483
利福平	西格玛-奥尔德里奇	R3501