基于显微技术的细菌在植物根部表面附着的评估

摘要

来源：Matthysse, A. G. 实验室条件下测定细菌对植物表面的黏附能力。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了利用相差显微镜评估细菌在植物根部附着情况的方法。首先将与细菌共孵育的幼苗根部样品制片，以检查是否存在游离细菌。随后对样品进行洗涤，以去除松散附着的细菌，并使用合适的盖玻片重新制片，防止样品受损。最后在显微镜下计数附着于根毛的细菌数量。

方案

1. 细菌接种

1. 根据用于测定细菌黏附的检测方法及孵育时间的长短，确定接种细菌的数量。
2. 对于孵育时间少于1天的显微镜研究，应接种相对大量的细菌。加入适量菌液，使最终细菌浓度超过每毫升10⁶个细菌。对于较长的孵育时间，应减少接种的细菌量。
3. 对于通过活菌计数测定细菌黏附的研究，加入适量菌液，使最终细菌浓度达到每毫升10³至10⁶个细菌。
4. 避免接种过多细菌，以免其代谢活动改变孵育介质的pH值或氧气浓度。使用pH试纸或电极测定pH值，使用氧电极测定氧气浓度。
5. 对于在沙中培养的植物，可通过以下三种方式之一进行接种。
   1. 在播种前将种子浸泡于每毫升约含10⁶个细菌的水悬液中1分钟，以实现种子接种。
   2. 通过无菌苗的萌发进行根部接种。当幼苗根长约达1 cm时，将其根部或整个幼苗浸入每毫升含10⁶个细菌的水悬液中1分钟。
   3. 在播种前将细菌与沙混合，使最终浓度约为每毫升10³个细菌；或在播种后用每毫升含10⁶个细菌的悬液浇灌幼苗，以实现沙的接种。

2. 细菌与植物材料的孵育

1. 在液体培养基中孵育时，将细菌与植物材料在无菌水、蔗糖和矿物盐溶液或植物组织培养基（如1/10稀释的Murashige和Skoog基础盐混合物或MS盐）中共同孵育。
   1. 使用细菌不易黏附的容器。尽量保持植物表面始终被液体覆盖，可通过完全浸没或轻柔振荡实现。剧烈振荡可能阻碍细菌黏附，甚至使已黏附的细菌从植物表面脱落。
   2. 在不同时间点用光学显微镜观察植物材料，以确定终止孵育和进行测量的合适时机。根据相互作用的速度，通常每隔1至4小时或每天取样一次，进行黏附过程的时间序列观察，这往往具有重要价值。
2. 若在沙质环境中孵育，请参照第2.1步中所述液体培养基孵育的相同原则进行操作。

使用显微镜测量黏附性

1. 使用微分干涉（Nomarski）或相差光学显微镜观察表面附着的细菌，以便于观察。然而，任何放大倍数为20X或更高的明场显微镜均可使用。
   1. 通过显微观察确定细菌是随机分布还是定位于特定位置。同时检查细菌是以单个形式结合还是以簇状形式存在。观察是否存在微菌落，以提示细菌在黏附后可能发生生长或被截留。检查细菌是否在表面形成生物膜。
      注意：生物膜是指大量结合在表面并被胞外基质包围的细菌群体。其结构可能平滑均匀，也可能具有更复杂的构型。
   2. 使用带有荧光标记的细菌。如果存在其他细菌，而目标细菌通过绿色荧光蛋白（GFP）等荧光标签进行识别，则可采用荧光显微镜来确定标记细菌是否存在于其他细菌的簇中。对于GFP，使用激发波长为490 nm、发射波长为520 nm的滤光片。
      1. 通过Nomarski和荧光光学手段，观察等量混合的野生型细菌与同菌株标记细菌在无菌材料上的黏附情况，以确认荧光标记是否对细菌产生不利影响。若荧光标记细菌与未标记细菌随机混合且数量相等，则表明该标记未干扰实验。
2. 确定附着细菌的数量。
   ​注意：在显微镜下准确计数附着细菌非常困难。当细菌结合于不规则的植物表面时，通常无法获得定量测量结果。扫描电子显微镜（本文未讨论）可用于此类测量。
   1. 当细菌结合于光滑表面（如根毛）时，可统计每毫米根毛长度边缘结合的细菌数量。比较测量结果时，应注意选用大小和形状相近的根毛。
   2. 为确定显微镜下物体的尺寸，可使用带有已知刻度的商用测微尺载玻片。在与实验样品相同的显微镜设置下观察并拍摄该测微尺载玻片，利用所得图像确定显微照片中物体的实际尺寸。
3. 制备显微观察样品。
   1. 清洗样品。将样品转移至载玻片上的水滴或培养介质中，直接进行观察。
      注意：此方法的优点在于，若无细菌生长或发生实际细菌死亡，则游离细菌数量应较少。若未观察到游离细菌，应警惕可能发生了细菌死亡，或细菌在孵育容器内壁发生了非特异性结合。样品清洗效果如图1所示。
   2. 将样品置于液体小瓶中，用清水或培养介质轻轻洗涤，通过轻柔倒置小瓶的方式实现温和清洗。随后将样品置于载玻片的新鲜液体中进行观察。
   3. 将样品置于液体中，使用普通盖玻片和载玻片进行封片。
      1. 若样品较厚，可能导致盖玻片下出现隆起，此时应使用压封式盖玻片。此类盖玻片边缘带有橡胶或塑料环。将液体和样品置于盖玻片的凹槽内，再将载玻片盖在上方，轻轻按压使盖玻片与载玻片密封。倒置后进行观察。
      2. 也可类似地使用藻类计数专用载玻片和配套盖玻片。需注意，此类具有一定深度的载玻片通常无法使用放大倍数超过20X的物镜进行观察。

结果

图1：测定结合细菌数量的样品制备步骤。Agrobacterium tumefaciens 结合到番茄根毛（A、B 和 C）以及尼龙丝（D、E 和 F）上。在未洗涤、直接置于水中的样品中，可见结合的细菌（黑箭头）和游离的细菌（白箭头）（A 和 D）。洗涤后，结合的细菌仍然保留，而游离的细菌则不再存在（B 和 E）。超声处理后，结合的细菌已从样品表面被去除（C 和 F）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
光学显微镜	任意	不适用	相位差或诺马尔斯基光学系统有助于观察，若使用荧光标记则需配备荧光显微镜。
种子	任意	不适用	请记录种子批次编号和品种
次氯酸钠溶液（漂白剂）	任意	不适用
超声波清洗仪	任意科学用品公司	不适用
吐温 X-100（Triton X-100）	Sigma-Aldrich	T9284
营养琼脂	Difco	2001-01-08
大豆蛋白胨（Soytone）	Difco	24360
沙子	海沙 Fisher Scientific	S25
沙子	Sigma-Aldrich	S9887
种植容器	Stuewe & Sons, Inc.	Ray-Leach 锥形容器	提供多种规格，可根据所培养植物的类型选择合适的尺寸
封口膜（Parafilm）	任意科学用品公司	不适用
MS 盐混合物	Sigma-Aldrich	M5524
塞奇威克-雷夫特计数池（Sedgwick-rafter counting cell）	Hauser Scientific	HS3800
探针夹式密封培养室（Probe-clip press-seal incubating chamber）	Sigma-Aldrich	Z359483
利福平（Rifampicin）	Sigma-Aldrich	R3501