癌性上皮细胞感染 Shigella 过程中的应激颗粒形成

摘要

来源：Vonaesch, P. et. al., 哺乳动物细胞经细菌攻击后应激颗粒形成的免疫荧光分析。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了上皮细胞感染致病菌 Shigella flexneri 的过程以及宿主细胞随之产生的应答反应。细菌效应蛋白会破坏宿主的翻译过程，从而诱导形成无膜细胞器——应激颗粒，后者反映了细胞对感染的适应性应答。

方案

1. 细菌与宿主细胞的准备

1. 使用无菌镊子将12 mm或14 mm的玻璃盖玻片分别转移至24孔板或12孔板中，每个实验条件对应一个孔。在超净台中通过紫外（UV）照射处理15分钟，对盖玻片进行灭菌。
   注意：应设置对照孔，用于细菌攻击实验，以及通过外源性应激诱导应激颗粒（SG）形成的实验。
2. 对于使用12 mm盖玻片的24孔板，每孔接种1 × 10⁵个哺乳动物细胞（例如 HeLa细胞）至盖玻片上；用无菌移液器枪头轻压盖玻片使其贴附。将细胞置于适宜其类型的培养基中，在37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育过夜，使其贴壁。
   注意：接种细胞时应控制密度，使次日细胞汇合度保持在40%–60%之间。
   1. 对于HeLa细胞，使用含非必需氨基酸（NEAA）和10%灭活胎牛血清（FCS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）进行培养。将FCS置于56 °C水浴中加热30分钟以灭活补体，加热15分钟后轻轻摇晃血清一次。
3. 为划线分离细菌，使用无菌移液器枪头从保存于-80 °C冰箱中的细菌甘油储备液（20%甘油）中取少量菌液，点接于已标记的平板上。用无菌接种环将细菌涂布至平板约10%的区域。更换新的无菌接种环，穿过原始涂布区域拉出三条平行线，长度约为半块平板。再依次穿过这三条线继续划线，覆盖平板其余区域。将平板置于37 °C培养过夜（O/N）。
   1. 从新鲜划线的平板上挑选单一细菌菌落（例如 Shigella flexneri）。避免使用超过1周的陈旧菌落。
   2. 对于S. flexneri M90T菌株，挑取新鲜划线的胰蛋白胨大豆琼脂-0.1%刚果红琼脂平板上的红色菌落，接种至15 mL离心管中含8 mL胰蛋白胨大豆肉汤的培养基中；拧紧管盖，在30 °C、222 rpm振荡条件下培养过夜（O/N）。注意：切勿使用大型白色菌落，因其已丢失毒力质粒，不具备感染性。

2. 宿主细胞的细菌攻击

1. 制备细菌以最大化其感染能力。
   1. 对于 S. flexneri将150 µL过夜培养物接种至8 mL胰蛋白胨大豆琼脂中，37 °C、222 rpm振荡培养至对数生长后期（约2 h），以诱导毒力基因表达并增强感染能力。
      1. 当菌液在600 nm处的光密度值介于0.6至0.9之间时，取1 mL菌液转移至1.5 mL离心管中。在8,000 × g条件下离心2 min以沉淀细菌，然后用感染培养基（含NEAA但不含FCS的DMEM）重悬，重悬至OD₆₀₀ = 1。因此，如果 OD₆₀₀ 为0.85，重悬于850 µL中。
         注意： 对于 S. flexneri 在 OD 处₆₀₀ = 1 时，将有 8 × 10⁸ 每毫升培养液中的细菌数量。感染复数（MOI）为20是合适的。对于其他病原体，OD值对应的每毫升细菌数量₆₀₀ 并且需要通过实验确定适当的感染复数（MOI）。
   2. 为增强细菌与宿主的相互作用，用聚-L-赖氨酸（PLL）包被细菌。
      注意： PLL处理 S. flexneri 对SG动态无影响。其他病原体是否适用于PLL处理尚需进一步评估。
      1. 为了用PLL包被细菌，将1 mL细菌培养物在8,000 × g下离心2分钟，然后将沉淀重悬于含10 µg/mL PLL的磷酸盐缓冲液（PBS）中，调节OD₆₀₀ = 1.
      2. 将菌液加入小培养皿中，例如12孔板中的一个孔，置于平板摇床中室温（约20 °C）轻柔振荡孵育10分钟。
      3. 8,000 × g 离心 2 分钟收集细菌，弃去多余的 PLL。将菌体沉淀重悬于 1 mL PBS 中，重复洗涤两次。最后一次洗涤后，将菌体重悬于感染培养基中，调整至 OD₆₀₀ = 1.
         注意： 此处，感染培养基用于 S. flexneri 含20 mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙烷磺酸)（HEPES）但不含胎牛血清的宿主细胞培养基。
2. 准备细胞以进行细菌攻击实验。
   1. 使用吸泵移除哺乳动物HeLa细胞的培养基。加入500 µL室温（RT）HeLa细胞培养基洗涤细胞，轻轻摇晃后，用吸泵移除培养基，再加入500 µL室温（RT）的适当感染培养基（例如含20 mM HEPES且不含FCS的宿主细胞培养基
   2. 注意： 所有洗涤步骤均需快速操作，每次处理不超过4个盖玻片，以避免细胞干燥。
3. 用细菌感染预先准备的HeLa细胞，使20%至50%的细胞被感染。
   注意： 每种细菌物种所需的合适时间和感染复数（MOI）均需单独确定。通常，可从37 °C下孵育30分钟、MOI为10的条件开始。
   1. 对于 S. flexneri 使用以下两种方法之一对 HeLa 细胞进行处理（步骤 2.3.1.1 或 2.3.1.2）。
      1. 离心未用PLL处理的细菌（20 µL OD₆₀₀ 以每孔500 µL培养基含1/孔（24孔板）的量，于13000 × g离心10分钟作用于细胞。
      2. 加入PLL包被的细菌（15 µL，OD₆₀₀ 在室温下，每24孔板孔中加入500 µL培养基，使细菌沉降到细胞上，孵育15分钟。
   2. 将含有已贴附细菌的细胞置于37 °C细胞培养箱中孵育30分钟，以允许感染发生。
      注意： 对于较短的时间点，进行同步 S. flexneri 通过将培养皿置于37 °C水浴中15分钟，而非组织培养孵育箱中，以实现感染。
4. 通过清洗细胞来阻止感染。
   1. 为清洗细胞并去除多余的细菌，使用抽吸泵吸出培养基，加入1 mL新鲜预热（37 °C）的HeLa细胞培养基（DMEM，10% FCS，NEAA）。轻轻晃动培养基后吸除，再更换为新的培养基。重复该步骤两次，最后保留新鲜培养基于细胞中。
      1. 对于 S. flexneri感染HeLa细胞并洗涤后，将培养基更换为含有50 µg/mL庆大霉素的标准组织培养基，以杀灭细胞外细菌并防止进一步的细胞侵袭。
         注意： 不要向培养基中添加抗生素以培养胞外细菌。
5. 在组织培养孵箱中，将细菌与细胞共孵育所需的时间。
   注意： 对于 S. flexneri，感染时间可能长达6小时，具体取决于细胞类型。对于HeLa细胞，在加入外源性刺激以诱导应激颗粒（SG）形成之前，让感染持续1.5至2小时。对于Caco-2细胞感染，在此情况下 志贺氏菌 在加入外源性应激因素前，让细菌在细胞间扩散并感染30分钟至6小时。此时可不施加外源性应激，直接固定细胞，以评估细菌感染所导致的应激颗粒（SGs）形成情况。

3. 应激颗粒形成的固定与免疫荧光分析

注意：为避免染色差异影响后续步骤中的图像分析，需同时处理对照组和实验组盖玻片。对照样本包括未感染且无应激颗粒诱导处理的样本，以及感染但无应激颗粒诱导处理的样本。

1. 使用抽吸泵完全移除培养基，并加入 0.5 mL 室温的 4% 多聚甲醛（PBS 配制）固定样品，在室温下孵育 30 分钟。
   注意： 多聚甲醛对操作人员和环境有害，应采取适当防护措施，并妥善处理化学废弃物。
   备注： 也可先固定 15 分钟，随后替换为预冷至 -20 °C 的甲醇继续固定 10 分钟，以更好地保留应激颗粒标记物的胞质定位。
2. 用移液器移除多聚甲醛溶液，并将液体弃入适当的废液容器中。用 1 mL 三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS：25 mM Tris，pH 7.3；15 mM 氯化钠，NaCl）洗涤盖玻片。洗涤过程中在摇床上轻轻振荡孵育 2 分钟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Shigella flexneri			可通过申请从多个实验室获得
胰蛋白胨酪蛋白大豆肉汤（TCS broth）	BD Biosciences	211825	Shigella 的标准培养基，用途：细菌生长
TCS 琼脂	BD Biosciences	236950	Shigella 的标准生长琼脂，用途：细菌生长
刚果红	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	用于区分丢失毒力质粒的 Shigella 的鉴别工具，用途：细菌生长
聚-L-赖氨酸（PLL）	Sigma-Aldrich	P1274	用于包被细菌以增强感染效率，用途：感染
庆大霉素	Sigma-Aldrich	G1397	选择性杀灭胞外细菌而保留胞内细菌，用途：感染
HEPES	Life Technologies	15630-056	在细胞于室温孵育时用作pH缓冲剂，用途：细胞培养
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Life Technologies	31885	HeLa细胞的标准培养基，用途：细胞培养
胎牛血清（FCS）	Biowest	S1810-100	HeLa细胞培养基中添加5%，用途：细胞培养
非必需氨基酸（NEAA）	Life Technologies	11140	HeLa细胞培养基中按1:100稀释使用，用途：细胞培养
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650	试剂稀释液，用途：细胞培养
多聚甲醛（PFA）	Electron Microscopy Sciences	15714	4% PFA用于细胞的标准固定，用途：固定
24孔细胞培养板	Sigma-Aldrich	CLS3527	标准组织培养板，用途：细胞培养
12 mm 玻璃盖玻片	NeuVitro	1001/12	用于免疫荧光实验的细胞培养载体，用途：细胞支撑
镊子	Sigma-Aldrich	81381	经济耐用且适用于大多数荧光染料的封片介质，用途：封片