小鼠肾脏组织中细菌定植的荧光成像

摘要

来源：Behera, R. K., et al. 一种基于荧光的方法用于研究感染组织中的细菌基因调控。 J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了一种制备感染小鼠肾组织、染色DNA以及利用双荧光报告系统检测细菌基因表达的方法。红色标记所有细菌，绿色突出显示感染响应性细胞。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 器官采集与组织处理
   1. 通过 CO 处死动物₂ 吸入麻醉，随后以颈椎脱位作为辅助方法处死，并进行剖检。
   2. 取材肾脏（右侧）及其他重要器官（心脏、肝脏、肺、脾脏），并转移至含有10% [v/v] 缓冲福尔马林的15 mL聚丙烯管中。
   3. 在室温下避光，以温和振荡或旋转方式固定器官，时间不少于24小时，但不超过48小时。
   4. 将器官包埋于透明组织冷冻介质中，并于 -80 °C 保存组织。
   5. 使用冷冻切片机将组织切成10 µm厚的切片。
   6. 在预先清洁并带电的玻璃载玻片上于避光条件下干燥切片20分钟。加入含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料的封片剂，并加盖盖玻片。将封片后的载玻片于室温下避光静置过夜，随后转移至4 °C长期保存。
2. 激光扫描共聚焦显微镜与图像处理
   1. 使用适用于所用荧光报告基因的激光，检查封片样本以定位病灶。本实验中采用绿色（GFP 或绿色荧光蛋白）、红色（tdTomato）和蓝色（DAPI）荧光信号。
   2. 使用适当的物镜获取图像，以观察单个细胞（例如，通常使用 20x 或 40x 物镜）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57Bl/6 小鼠	Charles River	NA
共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss	NA
冷冻切片机	Thermo Scientific	NA
磷酸盐缓冲液（PBS）	Cellgrow	46-013-CM
Precellys 24 匀浆仪	Bertin Laboratories	NA
Sub Xero 透明组织冷冻介质	Mercedes Medical	MER5000
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
含 DAPI 的 Vectashield 抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1500