利用活细胞荧光显微镜成像观察细菌的形态学变化

摘要

来源：Brzozowski, R. S. et al. 利用活细胞荧光显微镜研究细菌中亚细胞蛋白定位及细胞形态变化。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了活细胞荧光显微镜技术，用于实时观察细菌的形态变化。视频概述了成像、时间序列图像采集以及去卷积处理的步骤，以实现实时获取高分辨率图像。

方案

1. 成像

1. 实验当天，打开显微镜系统。启动成像软件（参见 材料表) ，方法是单击桌面上相应的图标。通过单击 初始化显微镜 在软件启动对话框中点击选项（按钮上标有显微镜图标）。初始化前，须使用显微镜粗调旋钮将物镜完全降下。
   注意： 初始化后，除了开始菜单外，还应出现三个额外的对话框：resolve3D、数据采集和滤波监控。
2. 在制造商提供的100倍油镜物镜（数值孔径 = 1.4，工作距离 = 0.12 mm）上滴加一滴折射率为1.517的浸油（见 材料表).
   注意： 选择适合成像温度的浸油至关重要。
3. 将装有样品的玻璃底培养皿放入金属载物台外壳（棺形架）中，并轻轻滑入载物台夹具。
4. 使用粗调旋钮将物镜抬升，直至油滴与培养皿的玻璃底部接触。通过目镜并调节细调旋钮，使样本清晰对焦。待细胞清晰成像后，将显微镜主体前方的切换开关向左拨动，将光路从目镜切换至相机模式。
5. 使用成像软件开始实验。在 resolve3D 窗口中，选择 设计/开展实验 烧瓶图标。此时应出现一个新对话框，标题为 设计/开展实验.
   1. 使用以下方法设置Z轴层扫描数量和样本厚度 设计 然后 切片 标签页上的 设计/开展实验 对话框
      注意： 在代表性结果部分的实验中，静态图像采用间隔为200 nm的17层Z轴堆栈，延时显微镜成像采用间隔为200 nm的4层Z轴堆栈。
   2. 为测量样品中细胞的厚度，使用键盘上下箭头逐级手动调节Z平面。 resolve3D 对话框。标记细胞失焦的位置，作为图像采集的上下限。在运行实验前导入此信息。
   3. 为减少延时成像过程中的光毒性和光漂白现象，应降低Z轴层扫数量，并选择细胞的中位平面进行图像采集。
6. 使用适合实验的滤光片组 设计 然后 通道 标签页上的 设计/开展实验 对话框（TRITC：激发 542/27；发射 597/45；FITC/GFP：激发 475/28；发射 525/48；mCherry：激发 575/25；发射 632/60；Cy5：激发 632/22；发射 676/34）
   1. 同时，选择用于采集偏光/微分干涉差（POL/DIC）信息的参考通道。在成像前，通过选择相应选项，调节所选各个通道的透光率（光强）和曝光时间。 resolve3D 对话框
      注意： 在不用于实验的测试视野中，先对这些设置进行测试，以确定所选参数能否在不遗漏弱信号或造成信号过饱和的情况下获得有意义的荧光数据。然后将这些参数导入实验设置中。
7. 通过选择打开点列表 要点列表 按钮 resolve3D 对话框。此时应出现一个新对话框，标题为 要点列表使用显微镜载物台控制装置找到合适的视野，然后在点列表对话框中选择标记点选项，标记多个将用于实验的视野。
   注意： 每次显微镜重新对焦到点列表中的某个点时，都必须选择一个替换点。这可以通过将显微镜对焦到列表中的相应点，然后选择该点来完成 替换点 按钮。重新对焦时切勿触碰模拟的粗调/微调旋钮；仅通过软件调整焦距。
8. 首先选择设计，然后设置延时参数 延时 在设计/运行实验对话框中点击选项卡。选中延时摄影复选框。根据延时图像/总时间输入适当的延时参数。
9. 从点列表中选择要成像的点作为设定点 设计 然后 点 在“设计/运行实验”对话框中点击相应选项卡。选择“访问点列表”选项，并在文本框中输入要成像的点位，各点位之间用逗号或连字符分隔（若为连续序列可使用连字符）。
10. 在开始实验之前，使用以下方法编辑文件名和文件存储位置 运行 在设计/运行对话框中点击标签。可通过选择更改文件位置 设置 按钮，选择数据文件夹，然后选择相应的文件夹或创建新文件夹。通过在图像文件名文本框中输入新的文件名来更改文件名。
11. 开始实验时，选择 播放 按钮 开始实验对话 盒子
    注意： 对于延时成像，在整个实验过程中需使用微分干涉差（DIC）设置持续检查每个视野的焦距（以避免不必要的光漂白），并根据细胞随时间推移容易失焦的情况重新对焦，及时更新点位列表中的信息。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Fisher BioReagents	BP160-100	分子生物学级 - 低电渗流（Low EEO）
FM4-64	Invitrogen	T3166	显微成像
玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.5-14-C	显微成像
显微镜	GE	DeltaVision Elite	定制 Olympus IX-71 倒置显微镜支架；定制照明塔和透射光照明模块。物镜：PLAPON 60X（数值孔径 1.42，工作距离 0.15 mm）；OLY 100X OIL（数值孔径 1.4，工作距离 0.12 mm）；100X 物镜用 DIC 棱镜（诺马尔斯基）；CoolSnap HQ2 相机；SSI 7 色光源组件；环境控制腔室 - 不透光。
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	FtsZ 抑制剂
SoftWorx	GE		厂商提供的成像软件