利用活细胞荧光显微镜成像细菌形态变化

Abstract

资料来源： Brzozowski， R. S. 等人。 活细胞荧光显微镜用于研究细菌中亚细胞蛋白定位和细胞形态变化。 J. Vis. Exp. （2019）

本视频演示了活细胞荧光显微镜技术，以可视化细菌的实时形态变化。它概述了成像、延时采集和解卷积等步骤，以实时获得高分辨率图像。

Protocol

1. 成像

1. 实验当天，打开显微镜系统。点击桌面上的相应图标，启动成像软件（见 材料表）。通过在软件启动对话框中点击“ 初始化显微镜 ”选项（按钮上显示显微镜）来初始化显微镜。确保在初始化前使用显微镜粗略调整物镜完全降低物镜。
   注意： 初始化后，除了开始菜单外，还应出现三个额外的对话框：resolve3D、数据收集和过滤监视器。
2. 在制造商提供的100倍油浸物镜上滴一滴1.517（折射率）的油（数值孔径=1.4，工作距离=0.12毫米;见 材料表）。
   注意： 选择适合成像温度的浸油非常重要。
3. 将装有样品的玻璃底盘装入金属外壳（棺材），并轻轻滑入舞台夹具中。
4. 用粗调节旋钮将物镜抬高，直到油接触到碟的玻璃底部。用目镜和微调旋钮将样品调到焦点。当细胞对焦后，将目镜旋钮从目镜切换到相机模式，方法是将显微镜前部的选择开关向左移动。
5. 使用成像软件开始实验。在 resolve3D 窗口中，选择由一个瓶子表示 的设计/运行实验 图标。应该会出现一个新的对话框，标题为 “设计/运行实验”。
   1. 用设计设置Z堆叠数量和样品厚度，然后在设计/实验对话框中设置切片标签。
      注意： 代表性结果部分的实验中，静态图像使用17个Z堆栈，间隔200纳米，4个Z叠片间距为200纳米进行延时显微镜。
   2. 要测量样品中单元厚度，可以通过 resolve3D 对话框上的上下箭头手动调整Z平面。标记像素失焦的位置作为图像采集的上下限。在运行实验前导入这些信息。
   3. 为了帮助减少延时成像中的光毒性和光漂白，减少Z堆叠数量，并选择细胞的中间平面进行图像采集。
6. 使用设计和通道标签，在设计/运行实验对话框中选择适合实验的滤波器集（TRITC： EX 542/27;EM 597/45;FITC/GFP：EX 475/28;EM 525/48;mCherry：EX 575/25;EM 632/60;Cy5：EX 632/22;EM 676/34）。
   1. 此外，选择一个参考文献以收集POL/DIC信息。通过在 resolve3D 对话框中选择相应选项，调整成像前选择的各个通道的透射率（光强）和曝光时间。
      注意： 在未被纳入实验的测试视野中，测试这些设置，以确定所选参数是否能获得有意义的荧光数据，而不会遗漏弱信号或导致过饱和。然后导入这些参数用于实验装置。
7. 通过在 resolve3D 对话框中选择点列表按钮打开点数列表。会出现一个名为“积分列表”的新对话框。通过使用显微镜阶段控制找到合适的视场，并在点列表对话框中选择标记点选项，标记实验中使用的多个视场。
   注意： 每次显微镜重新聚焦点列表中的某个点时，都必须选择一个替换点。这可以通过将显微镜聚焦在列表中的相应点，然后选择 替换点 按钮来实现。重新对焦时，重要的是不要触碰模拟粗/细调节旋钮;只需使用软件来调整对焦。
8. 通过先选择设计，然后在设计/运行实验对话框中选择 延时 标签页来设置延时参数。选择延时摄影复选框。输入相应的时间延时参数，比如延时图像/总时间。
9. 设置点，先选择设计，然后在设计/运行实验对话框中选点标签。选择访问点列表选项，并在文本框中输入要图像的点，如果是完整的序列，则用逗号或连字符分隔。
10. 在开始实验之前，请使用设计/运行对话框中的 运行 标签编辑文件名和文件位置。通过选择 设置 按钮、选择数据文件夹，然后选择相应文件夹或创建新文件夹，可以更改文件位置。通过在图片文件名文本框中输入新文件名来更改文件名。
11. 通过在“开始实验”对话框中点击播放按钮开始实验。
    注意： 对于延时摄影，在整个实验过程中，使用DIC设置持续检查每个视场的对焦（以避免不必要的光漂白），并随着细胞逐渐失焦，重新聚焦并更新点列表中的信息。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
琼脂糖	费舍尔生物试剂	BP160-100	分子生物学级别——低平等就业机会
FM4-64	Invitrogen	T3166	显微镜
玻璃底盘	MatTek	P35G-1.5-14-C	显微镜
显微镜	通用电气	三角洲视野精英	定制奥林巴斯IX-71倒置显微镜架;定制照明塔和透射光照明模块。物镜：PLAPON 60X（无标1.42，WD 0.15毫米）;OLY 100X 油（N.A. 1.4，WD 0.12 毫米）;DIC Prism Nomarski for 100X Objective;CoolSnap HQ2相机;SSI组装7色;环境控制室——不透明。
PC190723	米利波尔西格玛	3445805MG	FtsZ抑制剂
SoftWorx	通用电气		制造商提供的成像软件