所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 接种 单核细胞增生李斯特菌 通过尾静脉注射将细菌注入小鼠体内并评估肝脏、脾脏和心脏中的细菌载量
注意：所有动物实验均按照美国疾病控制与预防中心生物安全二级指南进行。小鼠通常需提前一周订购，每笼饲养5只。小鼠在注射前需在新实验室环境中适应四天。本实验使用6至8周龄的雌性Swiss-Webster小鼠，每笼5只，饲养于屏障环境中，并给予非限制性饮食。
- 每次准备一笼小鼠，取下笼盖及食物/饮水盒，将笼子置于加热灯下五分钟。此过程可使尾静脉扩张，便于进行注射。
- 取出一只动物，将其放入固定装置（或剪去末端的离心管）中，以在注射过程中限制其活动。
- 使用酒精棉片清洁注射部位，并等待酒精挥发。这不仅能清洁局部区域，还可进一步扩张尾部静脉。
- 使用带有27.5号针头的1 ml注射器，将200 μl所需培养物经尾静脉缓慢注射入小鼠体内。
- 使用纱布按压以止住注射可能引起的出血，并将动物放入清洁的笼具中。
- 对剩余的动物和品系重复此过程。务必在每个动物笼子上标注其所对应的品系。
- 每天检查动物，移除并处死任何出现病征的个体。若无动物表现出病症，则让感染持续72小时后处死全部动物。
- 为处死动物，使用 CO2 从气瓶来源给予麻醉，直至所有呼吸停止，然后采用颈椎脱位法以确保动物死亡。
- 处死后，将动物转移至组织培养操作台进行解剖。
- 使用解剖板，用粗针将动物的每条腿固定，并喷洒70%乙醇至动物组织完全浸润。
- 从阴道开口处开始，沿腹部和胸部向上做Y形切口，延伸至剑突，然后继续向上延伸至双侧腋窝。
- 向后剥离皮肤，并取下每条腿上的针，以保持解剖切口张开。
- 轻轻切开腹膜，暴露肠道、胃、肝脏和脾脏。
- 首先切断肝脏上方的肝静脉和冠状韧带，开始切除肝脏。肝脏下方还存在其他需要切除的韧带，这些韧带将肝脏连接至小肠的第一部分以及背部的肌肉组织。
- 将肝脏置于 5 ml 无菌 ddH₂O 中20，置于50 ml Falcon管中。
- 接下来，分离脾脏并轻轻剪除其血管和韧带，以摘除脾脏。脾脏比肝脏更容易取出。将脾脏置于另一含有5 ml无菌ddH₂O的Falcon管中20.
- 找到膈肌，沿肋骨轻轻剪开以显露胸腔。剪开剑突和胸骨直至颈部水平，打开胸腔，暴露心脏和肺。
- 用镊子轻轻夹住心尖，提起心脏，使主动脉和肺动脉处于张力状态。切断这些血管以游离心脏。
- 将心脏放入含有5 ml无菌ddH₂O的50 ml Falcon管中20.
- 弃去小鼠尸体，并对每只动物重复此过程，使用含有 5 ml 无菌 ddH₂O 的洁净 Falcon 管2每个器官移除时计为 0。
- 所有器官取出后，清理工作台并返回实验台。
- 为每组来自五只小鼠的器官准备5个试管，用于匀浆器的清洗和灭菌（即 一套5个试管用于5个肝脏，5个试管用于5个脾脏，以及5个试管用于5个心脏。每种组织对应的4个试管应各加入30 ml无菌ddH₂O20，另一个应装入30 ml 90% EtOH。
- 使用 TissueMaster（或等效的匀浆器），将正在运行的匀浆器探头浸入步骤 1.21 中准备好的各离心管中，以清洗探头，操作如下：
- 1号管（ddH₂O）2O）在2号管（ddH₂O）中5秒2O）在3号管（EtOH）中5秒，然后在4号管（ddH₂O）中5秒2O) 5 秒，置于 5 号管（ddH₂O）中2O
- 使用匀浆器匀浆一个肝脏，至少持续2分钟，直至肉眼观察不到组织块残留。用镊子清除探头上的任何大块残渣。
- 重复上述清洗步骤。
- 对其他肝脏重复匀浆过程，每次处理不同肝脏之间需按照所述步骤清洗探头。
- 所有肝脏完全匀浆后，弃去肝脏的洗涤管（1-5）。
- 对脾脏和心脏也重复进行匀浆/清洗步骤，确保每组器官使用一套新的清洗管。若清洗管在任何阶段变得浑浊，应立即弃用，并更换新管以完成该组操作。
- 所有器官组织完成匀浆后，对匀浆器进行最后一次清洗循环，并充分干燥后妥善保存。
- 将每种器官组织约 200 μl 分别加入 96 孔板的各个孔中。
- 对器官样本进行连续稀释，依次按1:10比例系列稀释至1:10,000（肝脏和脾脏）或至1:1,000（心脏）。
- 将系列稀释液点样至预热的LB琼脂平板上。同时，取每种未稀释器官样品20 μl，分别接种于独立的LB琼脂平板，以计数定植程度较低的器官中的菌落形成单位（CFU）。
- 弃去含有匀浆器官的离心管，用封口膜包裹含有梯度稀释液的96孔板，并将其置于-80 °C冻存盒中。
- 让斑点自然晾干。将培养皿放入通风橱并打开皿盖可加快干燥过程。
- 待斑点干燥后，将平板置于37 °C培养箱中过夜。
- 次日早晨对每个点上的菌落数量进行计数，并利用稀释系列计算每器官中的细菌总数。