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所有涉及动物样本的程序均已经过相关动物伦理审查委员会的审查和批准。
1. 感染
- 获取10至12周龄的两性BALB/c小鼠。
注： 肺炎链球 菌血清型4型TIGR4是一种具有毒性的临床分离株，已被测序。 - 在Todd-Hewitt汤中，37°C、5%CO2 中培养TIGR4，直到达到光学密度（OD）620 为0.5（对应1.0 x 108 个菌落形成单位[CFU]/ml）。将肺炎球菌培养液以离心法在3500 x g下沉淀10分钟，然后用真空管去除上清液。用无菌磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）悬浮并稀释细菌，最终浓度为1.0 x 104 CFU/ml。
- 利用诱导腔，用2.5%汽化异氟醚在氧气中麻醉小鼠。用钝镊轻捏脚趾确认麻醉状态。
- 用一只手抓住麻醉小鼠的颈背并保持直立，使用带有27-30号针头的注射器（相当于挑战剂量1.0 x 103 CFU）向每只小鼠腹腔内注射100微升肺炎杆菌悬浮液（即腹腔内注射）。把老鼠放回笼子里。小鼠通常在注射后30-40秒醒来。
- 让感染持续至少24小时（早期）或30小时（晚期）。
- 通过二氧化碳窒息安乐死老鼠。进行宫颈脱位以确保老鼠已经死亡。在第1.6步中，心脏被取出进一步确认安乐死。
- 用酒精棉签消毒尾巴，剪下2-3毫米的切片。采集2微升血液，并连续将血液稀释为含肝素1U/ml的PBS10倍，共五次。在三叉化大豆血琼脂平板上进行序列稀释，并在37°C、5%CO2中过夜孵育。第二天，从菌群推算菌血症水平。
- 将小鼠固定在手术平台上，使其仰卧。用70%乙醇喷胸并拍干。使用外科剪刀和镊子，打开胸腔，取出肋骨，并切断膈肌以暴露心脏和肺部。用剪刀切断连接心脏的血管，轻柔切除心脏，避免用镊子擦伤。
- 用PBS冲洗心脏，然后将其放入组织样本采集盒中，以便在组织切片时进行冠状切片。对于石蜡嵌体，将胶囊置于10%缓冲甲醛溶液中，第二天进行石蜡嵌合。
- 或者，使用最佳切割温度（O.C.T.）化合物在置于干冰上的冷冻剂中进行速冻。
2. 病变中心脏病变和肺炎球菌的可视化
- 切除嵌有石蜡的心脏切片，使每个组织切片中都可见心脏的四个腔室。切片厚度为5微米。
- 使用标准方法去除石蜡和伊苏氨酸（H&E）染色载玻片。
- 使用光学显微镜在低倍（100X、200X）和高倍（油浸：400X、1000X）下观察H&E染色的心脏切片。检测心脏心肌中是否有微病变。在这里，使用配备100X 1.3数值孔径Plan-NEOFLUAR物镜的蔡司Axioskop 2显微镜获取H&E图像。
注意：在早期阶段，心脏病变通过其不同颜色的外观以及在某些情况下存在的免疫细胞（单核细胞和颗粒细胞）来区分，这些细胞看起来是单核细胞。在晚期病变，尤其是30小时时出现的病变中，免疫细胞缺失，取而代之的是大型液泡状病变。需要注意的是，虽然在心脏病变早期阶段免疫细胞涌入可能发生，但这似乎并非必需。