小鼠心脏组织中细菌微小病灶的显微观察

摘要

来源： 布朗，A. O. 等 可视化 肺炎链球菌 心脏微损伤内的变化及随后的心脏重构。 视觉实验杂志. (2015).

本视频展示了小鼠心脏组织中细菌微小病灶的显微观察。取感染肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的小鼠心脏，经清洗和固定后，制备冠状切片。切片经苏木精-伊红染色后，在显微镜下观察，以识别存在于微小病灶内的细菌。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 感染

1. 取10至12周龄的BALB/c小鼠，雌雄均可。
   注意：Streptococcus pneumoniae 4型菌株TIGR4是一种具有毒力的临床分离株，其基因组已被测序。
2. 在37 °C、5% CO₂条件下，将TIGR4菌株接种于Todd-Hewitt液体培养基中培养，直至光密度（OD）₆₂₀达到0.5（相当于1.0 × 10⁸菌落形成单位[CFU]/mL）。在3,500 × g条件下离心10分钟，收集肺炎链球菌菌体，用真空泵吸除上清液。用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重悬并稀释细菌，使其终浓度为1.0 × 10⁴ CFU/mL。
3. 使用诱导室，以含2.5%气化异氟烷的氧气对小鼠进行麻醉。用钝头镊子轻轻夹捏脚趾，确认小鼠已进入麻醉状态。
   1. 用一只手抓住麻醉后小鼠的颈背部皮肤并使其直立，使用带有27–30号针头的注射器，向每只小鼠腹腔内（i.p.）注射100 µL S. pneumoniae菌液（相当于攻击剂量为1.0 × 10³ CFU）。将小鼠放回笼中。小鼠通常在注射后30–40秒内苏醒。
4. 让感染进程持续至少24小时（早期）或30小时（晚期）。
   1. 采用CO₂窒息法处死小鼠。行颈椎脱位以确保小鼠死亡。在步骤1.6中通过取出心脏进一步确认死亡。
5. 用酒精棉片对小鼠尾部进行消毒，剪去2–3 mm的尾尖。采集2 µL血液，加入含1 U/mL肝素钠的PBS中，进行5次10倍系列稀释。将系列稀释液接种于胰蛋白酶大豆血琼脂平板上，在37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。次日根据菌落计数推算菌血症水平。
6. 将小鼠仰卧位固定于手术台上。胸部喷洒70%乙醇后轻轻擦干。使用手术剪和镊子打开胸腔，移除肋骨，横断膈肌以暴露心脏和肺脏。用剪刀剪断与心脏相连的血管，小心用镊子轻轻摘除心脏，避免镊子造成组织挫伤。
7. 用PBS冲洗心脏，然后将其放入组织标本包埋盒中，确保在后续组织切片时可获得冠状切面。如需石蜡包埋，将包埋盒置于10%中性缓冲福尔马林溶液中，次日送检进行石蜡包埋。
   1. 或者，可将心脏置于置于干冰上的冷冻模具中，使用最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂进行速冻。

2. 心脏病灶内病灶及肺炎链球菌的可视化

1. 切取包埋在石蜡中的心脏组织切片，确保每个组织切片中均可见心脏的四个腔室。切片厚度为 5 µm。
2. 采用标准方法对切片进行脱蜡，并用苏木精和伊红（H&E）染色。
3. 在低倍（100X，200X）和高倍（油镜：400X，1,000X）下，使用光学显微镜观察 H&E 染色的心脏切片。根据心肌中是否存在微小病变对心脏进行表征。此处使用配备 100X 1.3 数值孔径 Plan-NEOFLUAR 物镜的 Zeiss Axioskop 2 显微镜采集 H&E 图像。
   注意：在早期阶段，心脏病变可通过其不同的着色外观加以区分，有时可见免疫细胞（单核细胞和粒细胞）的存在，这些细胞表现为单核细胞。在进展期病变中，尤其是在 30 小时时观察到的病变，免疫细胞消失，取而代之的是较大的空泡样病变。需要强调的是，尽管在心脏病变早期发育阶段可能出现免疫细胞浸润，但这似乎并非必要条件。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
托德-休伊特肉汤	Neogen	7161A
O.C.T.（最佳切割温度）包埋剂	Tissue-Tek (Sakura Finetek)	4583
组织粘附载玻片	Polysciences, Inc	24216
Paralube 宠物用软膏	Dechra	12920060
苏木精-伊红染色试剂盒	未指定		标准