对小鼠心脏组织切片中充满细菌的微小病灶进行免疫染色以用于成像

摘要

来源：Brown, A. O., 和 Orihuela, C. J. 肺炎链球菌在心脏微小病变中的可视化及其后续心脏重塑。J. Vis. Exp. (2015)

该视频展示了对化学固定的鼠类心脏组织切片进行免疫染色，以观察感染诱导的微小病灶内定位的致病菌。该过程包括组织洗涤、膜通透化、非特异性位点封闭、抗体标记、核复染以及共聚焦显微镜检测，用于识别和定位细菌簇集。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 感染

1. 获取10至12周龄的BALB/c小鼠，雌雄均可。
   注意： 肺炎链球菌 血清型4菌株TIGR4是一种已被测序的高毒力临床分离株。
2. 在37℃下，于Todd-Hewitt肉汤中培养TIGR4 °C，5% CO₂₂ 直到培养物在620 nm处的光密度（OD₆₂₀0.5（对应于1.0） × 10⁸ 菌落形成单位 [CFU]/ml）。通过离心沉淀肺炎链球菌培养物，3,500 × g 离心 10 分钟 × g，并使用真空泵吸除上清液。用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重悬并稀释细菌，使其终浓度为1.0 × 10⁴ CFU/ml
3. 使用诱导室，以氧气中2.5%气化异氟烷对小鼠进行麻醉。用钝头镊子轻捏脚趾，确认小鼠已进入麻醉状态。
   1. 用一只手抓住麻醉小鼠的颈部皮肤并使其直立，对每只小鼠进行腹腔注射（腹腔注射（i.p.） 100 µ的 S. pneumoniae 使用27-30号针头的注射器将悬液（相当于攻毒剂量为1.0） × 10³ 菌落形成单位（CFU）。将小鼠放回笼中。小鼠通常在注射后30-40秒内苏醒。
4. 让感染持续至少24小时（早期）或30小时（晚期）。
   1. 采用二氧化碳窒息法处死小鼠。通过颈椎脱位确保小鼠已死亡。在步骤1.6中通过摘除心脏进一步确认动物死亡。
5. 用酒精棉片消毒尾部，剪去2-3毫米组织，收集血液样本。 µl 血液，用含 1 U/ml 肝素钠的 PBS 将血液进行 10 倍系列稀释，共稀释五次。将系列稀释液接种于胰蛋白酶大豆血琼脂平板，37℃ 培养过夜 °在5% CO₂条件下于37°C培养。次日根据菌落计数推算菌血症水平。
6. 将小鼠仰卧位固定于手术台上。用70%乙醇喷洒胸部，轻轻擦干。使用手术剪和镊子打开胸腔，移除肋骨，横切膈肌以暴露心脏和肺。用剪刀剪断与心脏相连的血管，小心地用镊子轻轻摘除心脏，避免镊子造成挫伤。
7. 用 PBS 冲洗心脏，然后将其放入组织标本包埋盒中，确保在组织切片时可获得冠状面切片。对于石蜡包埋，将包埋盒置于 10% 缓冲福尔马林溶液中，次日送检进行石蜡包埋。
   1. 也可将组织置于已放置于干冰上的冷冻模具中，使用最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂进行速冻。

2. 心脏病灶及病灶内肺炎链球菌的可视化

1. 切取包埋在石蜡中的心脏组织切片，确保每个组织切片中均可见心脏的四个腔室。切片厚度为 5 µm。
2. 采用标准方法对切片进行脱蜡，并用苏木精和伊红（H&E）染色。
3. 在低倍（100×，200×）和高倍（油镜：400×，1,000×）下，使用光学显微镜观察 H&E 染色的心脏切片。根据心肌中是否存在微小病变对心脏进行表征。此处使用配备 100× 1.3 数值孔径 Plan-NEOFLUAR 物镜的蔡司 Axioskop 2 显微镜采集 H&E 图像。
   注意： 在早期阶段，心脏病变可通过其不同的着色外观加以区分，在某些情况下还可观察到免疫细胞（单核细胞和粒细胞），这些细胞表现为单核细胞。在进展期病变中，尤其是在 30 小时时观察到的病变，免疫细胞消失，取而代之的是较大的空泡样病变。需要强调的是，尽管在心脏病变早期发育阶段可能出现免疫细胞浸润，但这似乎并非必要条件。

3. 微病变内肺炎链球菌的免疫荧光显微镜检测

1. 使用切片机在冷冻模具中对心脏进行切片，厚度为5 μm，将切片置于带正电荷的玻璃载片上。让冷冻的心脏切片解冻并自然风干。用10%中性缓冲福尔马林（25℃时pH为6.8–7.2）固定切片10分钟。 °C）。
2. 洗涤载玻片（3次）×在 PBS 中洗涤 5 分钟，用含 0.2% Triton X-100 的 PBS 透化处理 15 分钟，然后再次用 PBS 洗涤。
3. 用含10%正常山羊血清的PBS溶液在载玻片上对组织切片进行封闭，孵育1小时。
4. 用 PBS 清洗载玻片，覆盖后在 37°C 下，将心脏切片与兔抗 4 型肺炎链球菌抗血清（1:1,000，溶于含 10% 山羊血清的 PBS）孵育 2 小时 °C.
   注意： 作为阴性对照，研究人员应使用未免疫兔抗血清
5. 用 PBS 洗涤后，加入含 10% 山羊血清的 PBS 溶液，覆盖切片，并在 37 °C 下与 1:2,000 稀释的山羊抗兔异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗体孵育 30 分钟 °C.
6. 根据制造商说明，使用5 mg/ml的DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）对真核细胞核进行染色可视化。用FluorSave洗涤并封片组织切片。
7. 使用共聚焦显微镜系统在低倍和高倍放大下采集荧光图像。根据需要调整数值孔径以获得最佳结果。此处，使用配备60倍物镜的共聚焦系统采集荧光图像。× 1.42 数值孔径物镜

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Todd-Hewitt 肉汤	Neogen	7161A
O.C.T. 包埋剂	Tissue-Tek (Sakura Finetek)	4583
Triton X-100	Fisher Scientific (Acros)	9002-93-1
正常山羊血清	Abcam	ab7481
抗4型肺炎链球菌抗血清	Statens Serum Institut	16747
山羊抗兔 FITC 标记抗体	Jackson ImmunoResearch	111-096-144
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluorsave 封片剂	Millipore	345789
Permount 封片介质	Fisher Scientific	S70104
氨苄青霉素	Sigma	A9393
组织粘附载玻片	Polysciences, Inc	24216
Paralube 宠物用软膏	Dechra	12920060
苏木精-伊红染色试剂盒	未指定		标准