基于PCR的富集蝇类样本中食源性病原体检测

摘要

来源：Pava-Ripoll，等．从单只污秽蝇类中检测食源性细菌病原体．J. Vis. Exp. （2015）

本视频展示了一种基于 PCR 的方法，该方法利用病原体特异性试剂片从富集的果蝇样本中扩增目标细菌 DNA，实现对食源性病原体在单个昆虫中存在情况的实时荧光检测和熔解曲线分析。

方案

1. 水化PCR（聚合酶链式反应）预混冻干粉

1. 选择一个预冷（4 °C）的PCR冷却块，并将PCR管架放在插入孔上。
2. 根据管架文件，将含有目标食源性致病菌PCR-ready试剂片（每个试剂盒中均包含）的相应PCR管放入管架中。
3. 使用去盖工具，小心移除PCR管的管盖。丢弃管盖，并确认每根管内均含有试剂片。
4. 向特定PCR管中加入50 µl（针对Salmonella和Cronobacter）或30 µl（针对L. monocytogenes）的裂解液。使用新的光学管盖，并用封盖工具将其牢固地盖紧在PCR管上。
   注意：在将裂解液加入PCR-ready试剂片后，样品必须在2 - 8 °C条件下保持冷藏，直至加载至基于PCR的检测系统中。PCR管可在2,500 × g离心数秒，以确保全部液体沉降至管底。
5. 打开仪器抽屉，将PCR管加载至PCR扩增仪/检测系统中。
6. 将PCR管架放入抽屉的孔位中，并检查确认各管已正确就位。
7. 关闭抽屉，并按照制造商的操作说明启动程序。
   注意：基于PCR的仪器已预设针对每种食源性致病菌的扩增循环参数。
8. 确认PCR扩增状态条显示蓝色条带，表明程序的扩增阶段正在运行。
   注意：对于标准PCR检测，整个程序（扩增与检测）的处理时间大约需要3 - 3.5小时完成。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
封盖工具	DuPont	D11677028
去盖工具	DuPont	D11134095
PCR管架/管座	DuPont	D12701663
细尖直头镊子	BioQuip	4731	使用前需灭菌。多家供应商可提供。
冷却块			多家供应商可提供。
离心机			多家供应商可提供。