一种基于快速成像的表面诱导细菌毒力筛选检测方法

摘要

来源： Perinbam, K., 和 Siryaporn, A. 利用阿米巴进行快速基于图像的细菌毒力检测。 J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种快速的基于成像的方法，通过将阿米巴与表面附着或浮游状态的细菌共孵育，施加钙黄绿素-乙酰氧基甲酯（calcein-AM）琼脂糖凝胶垫，并成像荧光信号以检测宿主细胞损伤，从而评估细菌毒力。

方案

1. 显微镜观察——琼脂垫的制备

1. 在阿米巴原虫准备与之混合前约30分钟至1小时，制备琼脂垫 铜绿假单胞菌.
2. 在250 mL锥形瓶中，将50 mL含1% (w/v) 琼脂的发育缓冲液（DB）微波加热。每20秒摇匀一次，直至琼脂块完全消失。
3. 将熔化的琼脂放入预热至55 °C的水浴中冷却15分钟。
4. 向锥形管中的15 mL熔融琼脂中加入15 µL的钙黄绿素-AM储备液。轻轻倒置管子4–5次以混匀，并立即进行下一步操作。
   注意： 在聚丙烯15 mL离心管中进行此步骤。请勿使用厚壁玻璃容器，否则会导致琼脂过快凝固。
5. 将熔化的琼脂混合物倒入一块12 cm × 10 cm的玻璃板上，室温下静置10分钟，使琼脂凝固。将玻璃板置于印有网格的纸上，使用金属直尺沿网格线切割，将凝固的琼脂垫切成若干个1.5 cm × 1.5 cm的小片。
6. 在使用前，将凝胶置于湿盒中保持湿润。

2. 显微成像——细菌-阿米巴样品的制备

1. 为了检测附着在表面的细菌细胞的毒力，将10 µL的阿米巴细胞加入到表面附着的细菌中。
   注意：此步骤描述了将阿米巴细胞与细菌混合的操作。
2. 为了检测浮游细胞的毒力，将10 µL的阿米巴细胞与10 µL的浮游细菌混合。
   注意：在与细菌混合前，不要洗涤无菌培养的阿米巴细胞（OD₆₀₀ 为0.2至0.5）。由于使用了抗生素-抗真菌溶液，阿米巴培养物中不会观察到E. coli的生长。
3. 立即将在步骤1.5中制备的1.5 cm × 1.5 cm的钙黄绿素-AM琼脂垫放置于培养皿表面的细菌-阿米巴混合物上方。
   注意：使用快速、平稳的动作将琼脂垫放置在混合物上。切勿缓慢地将琼脂垫放下，因为这种动作容易将细胞推向边缘，并远离琼脂垫的底面。此步骤可确保细菌和阿米巴细胞均匀混合、固定，并使两种细胞类型均被限制在同一平面上。
4. 用移液器轻轻吸除琼脂垫周围残留的多余液体。将培养皿在室温下干燥20分钟。
5. 用盖子盖好培养皿，并将固定的阿米巴-细菌混合物在室温下继续孵育40分钟。然后进行步骤3.1。
   注意：所有样品的孵育时间必须保持一致，因为背景荧光会随时间增加。建议总孵育时间为1小时。超过1小时的孵育重复性较差，因为阿米巴细胞可能开始破裂。

3. 显微镜 - 图像采集

1. 使用能够获取明场和绿色荧光图像的荧光显微镜对变形虫进行成像。对于绿色荧光，使用绿色荧光蛋白（GFP）滤光片，激发波长为474/27 nm，发射波长为525/45 nm。采用10X（数值孔径≥0.3）的物镜对变形虫进行成像。
   注意：琼脂中的钙黄绿素-AM会导致死亡的变形虫在绿色荧光通道中发出荧光，而健康的变形虫则无荧光。
2. 调整相差通道和GFP通道的采集时间，以减少光毒性并优化图像强度的动态范围。如有需要，可用微分干涉相差（DIC）代替相差成像。
   注意：尽可能将相差和GFP荧光的曝光时间设置为100–200 ms。在整个实验过程中保持曝光时间和仪器设置不变，这对于准确计算宿主杀伤指数至关重要。
3. 至少获取100个变形虫细胞的图像，以获得足够的统计学数据用于计算宿主杀伤指数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
Bacto琼脂，脱水	BD Difco	214010
抗生素-抗真菌素（100X）	Life Technologies	15240062	分装 < 1 mL 并于 -20 °C 保存
钙黄绿素-乙酰氧基甲酯（calcein-AM）	Life Technologies	C34852	钙黄绿素乙酰氧基甲基（AM）
氯化钙，无水	Sigma-Aldrich	C1016
D-葡萄糖	Fisher Chemical	D16500	右旋糖
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D5879
叶酸	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
酵母提取物	Oxoid	LP0021
特殊蛋白胨	Oxoid	LP0072
氢氧化钾	Fisher Chemical	P250
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P0662
七水合磷酸氢二钠	Fisher Chemical	S373
维生素B12	Sigma-Aldrich	V2876
菌株
Dictyostelium discoideum	Siryaporn 实验室	菌株 AX318
Escherichia coli	Siryaporn 实验室	菌株 B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn 实验室	PA14	PA14 菌株19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Siryaporn 实验室	AFS20.1	源自PA14的菌株20
耗材
0.22 µm 滤膜	Millipore	SCGPT01RE	用于过滤除菌
15 mL 锥形管	Corning	352097
玻璃储存瓶	Pyrex	13951L	250 mL、500 mL、1000 mL
培养皿，直径6 cm	Corning	351007	60 × 15 mm 聚苯乙烯培养板
培养皿，直径10 cm	Fisher	FB0875712	100 × 15 mm 聚苯乙烯培养板
带盖塑料容器	Ziploc	2.57E+09	方形3杯容量容器
玻片	Bio-Rad	1653308	用于制备琼脂垫。其他具有相似尺寸的玻片也可使用。
木棒	Fisher	23-400-102
设备
Eclipse Ti-E 显微镜	Nikon	MEA53100	显微镜配置
10X Plan Fluor Ph1 物镜，0.3 NA	Nikon	MRH20101	显微镜配置
荧光激发光源	Lumencor	Sola light engine	显微镜配置
荧光滤光片组	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	显微镜配置
Orca Flash 4.0 V2 相机	Hamamatsu	77054098	显微镜配置
ImageJ	NIH	v. 1.49	图像分析软件
MATLAB	Mathworks	R2013	图像分析软件
轨道摇床培养箱	VWR	89032-092	用于在37 °C下培养细菌
平台摇床	Fisher	13-687-700	用于在22 °C下培养变形虫
分光光度计	Biochrom	Ultrospec 10
台下式冷藏培养箱	Fisher	97990E	用于在22 °C下培养变形虫
Isotemp 水浴锅	Fisher	15-462-21Q	用于将培养基冷却至55 °C