评估感染研究中小鼠脾脏的细菌负荷

摘要

来源：Madenspacher, J. H. 和 Fessler, M. B. 小鼠实验性细菌性肺炎诱导与表型分析的一种非侵入性且技术要求低的方法。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了通过定量感染小鼠脾脏中的细菌载量来评估感染严重程度的过程。将脾脏组织匀浆后进行连续稀释并涂布平板，以测定总细菌负荷。所得数据可揭示病原体与宿主在全身组织中的相互作用。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠经口咽部吸入Klebsiella pneumoniae的气管内接种

1. 确保小鼠通过尾部标记、纹身或其他经批准的标识方法进行唯一识别。
2. 使用P200移液器在将小鼠移出异氟烷前预先吸取细菌接种剂量，以加快操作流程。为获得最佳气管内滴注效果，应使用以下体积： <100 µl 以防止溢出。此处使用 2000 菌落形成单位 (CFU)/50 µl 的 K. pneumoniae.
3. 在透明麻醉舱中使用异氟烷气体对小鼠进行麻醉（例如，2%异氟烷，流速为1 L/min）或根据机构指南进行。每次麻醉的小鼠数量由实验人员的操作舒适度决定，通常为1-2只。观察呼吸情况，当可见深呼吸且呼吸间隔可达2-3秒时，确认已达到麻醉深度。注意： 如果担心挥发性（吸入性）麻醉剂可能产生的混杂效应，可改用腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪进行麻醉。采用上述方法时，深度麻醉仅持续数分钟。若实施更长时间的麻醉，应使用眼膏以防止眼球干燥。
4. 小鼠麻醉后，将其置于半卧位仰卧姿势，通过上颌门齿悬挂在倾斜的有机玻璃板上的钉子间拉伸的橡皮筋上（图1).
5. 用一对钝头无齿镊子轻轻将小鼠舌头向一侧牵拉，再用P200移液器将给药剂量注入口腔内。操作时需格外小心，避免对舌头或口咽部造成损伤。
6. 在保持舌头回缩的同时，用戴手套的手指轻轻堵住小鼠鼻孔，直至其开始吸气。持续遮盖鼻孔，直到小鼠完成两次或更多次吸气，且口腔内无可见液体为止。由于小鼠为 obligate nose breathers（必须通过鼻腔呼吸），遮盖鼻孔有助于确保小鼠将细菌吸入肺部。
7. 将小鼠从接种板上取下并放回笼中，将其置于仰卧位，以防止在小鼠从麻醉中恢复期间垫料或碎屑堵塞鼻孔。
8. 所有小鼠给药完毕并从麻醉状态清醒后，将小鼠饲养于独立隔间或房间内，且该空间仅容纳接受过相同给药处理的小鼠 K. pneumoniae 每天监测小鼠，包括体重，若感染后时间超过48小时。
9. 若让小鼠超过48小时，则需每日更换垫料和/或提供辅助加热。

2. 测定肺部及外周组织中的细菌载量

1. 开始前：为肺和脾准备含有900 µl 1×磷酸盐缓冲液（PBS）的稀释管，为血液准备含有90 µl 1× PBS的稀释管。标记用于细菌培养的平板并置于室温下；这样在组织采集后，可最大限度缩短从匀浆到接种培养之间的时间。
   注意：由于通过吸入感染可能导致细菌在肺部沉积不均，建议每只小鼠仅用于分析总气道细胞数量或总（双侧）肺细菌负荷，二者选其一。
2. 根据机构指南实施小鼠安乐死。此处采用150 mg/kg剂量的戊巴比妥钠注射致死，或等效剂量的商品化安乐死溶液，随后进行放血。此方法可避免因CO₂吸入和颈椎脱位可能引起的肺部并发症。
3. 取出脾脏并放入含有2 ml 1× PBS的容器中，将管子置于冰上。每次处理不同组织或小鼠之间，需用乙醇清洁器械。
4. 在冰上对组织进行匀浆，建议使用一次性匀浆器，并在每个样本之间更换。一次性匀浆器头可在实验间高温高压灭菌后重复使用。
5. 组织匀浆完成后，进行系列稀释并接种平板。通过在塑料平板上划线分隔，将同一组织/稀释度的样品以双复孔形式接种于同一块胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上。以下列出了接种与稀释建议（所有情况下均取10 µl样品涂布于平板），该建议基于感染后24小时的解剖结果。若分析48–72小时的样本，由于后期细菌负荷增加，可能需要接种更多稀释梯度。
   1. 对于脾脏：将100 µl匀浆后的脾组织依次加入900 µl无菌1× PBS中，进行1:10至1:100的稀释。对原始匀浆液及两个稀释度均进行双复孔接种。
6. 让涂布的样品短暂干燥。
7. 将TSA平板倒置，放入37 °C静置培养箱中过夜培养。
8. 通过计算平板两侧及各稀释度的菌落数平均值，确定定植细菌数量。结合肺组织初始体积5 ml、脾组织初始体积2 ml的稀释因素，计算各组织总的菌落形成单位（CFU）。

结果

图1： 小鼠吸入性肺炎操作流程板 实验小鼠被固定于板上，头部朝上，背部紧贴板面即，半卧位），通过门齿悬挂在固定于亚克力板或类似板材上两根钉子之间的橡皮筋上。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ATCC	43816
Becton Dickenson	211825
本实验室自行配制	不适用	蒸馏水 (5 L)、NaCl (40 g)、KCl (1 g)、Na₂HPO₄ (5.75 g)、KH₂PO₄ (1 g)