感染小鼠肠道组织中氨基酸代谢物的可视化

摘要

来源：Specker, J. T., et al．利用成像质谱技术分析琼脂上及感染过程中组织内细菌菌落以研究微生物协作．J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱技术在可视化感染小鼠肠道组织中氨基酸分布的应用 艰难梭菌，单独使用或联合使用 粪肠球菌该过程包括组织制备、基质涂布、激光电离以及氨基酸离子的检测，以生成空间离子图像。结果揭示了微生物间的协同作用， E. faecalis 通过释放鸟氨酸和消耗精氨酸，改变肠道环境，从而增强 C. difficile 发病机制

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 非感染性对照样本的制备与运输 艰难梭菌感染的 小鼠盲肠组织
   1. 将4至8周龄的C57BL/6雄性小鼠接种抗生素（饮水中添加0.5 mg/mL头孢哌酮或0.5 mg/mL头孢哌酮联合1 mg/mL万古霉素） 随意 5天，随后进行2天恢复期，再进行感染。
   2. 通过 CO 处死动物₂ 窒息处死小鼠后立即取出盲肠器官。将其包埋于含20%最佳切割温度（OCT）包埋剂的蒸馏水混合液中。
   3. 将样品置于干冰上，随后包装并运送至分析地点；或在分析前于-80 °C保存。

 

2. 非感染对照与C. difficile感染小鼠盲肠组织的冷冻切片

1. 使用100%乙醇冲洗所有冷冻切片设备，晾干后将样品放入冷冻切片机腔室。使用欧姆表检测载玻片的导电涂层一侧，以确定ITO涂层载玻片的涂层面。使用金刚石笔在ITO涂层载玻片的涂层侧进行刻蚀并标记。
   注意：应佩戴适当的个人防护装备，包括手套、护目镜、实验服和冷冻切片机专用袖套。
2. 在科研用冷冻切片机上进行切片。将包埋在OCT中的小鼠盲肠组织从-80 °C冰箱中取出，置于干冰上，转移至冷冻切片机腔室（腔室温度30 °C，样品温度-28 °C）。将需通过成像质谱技术进行比较的组织样本（例如，未感染对照组与C. difficile感染组）置于同一张载玻片上，以确保两种组织样本的制备条件一致，便于准确比较代谢物。
3. 在冷冻切片机腔室内，使用额外的OCT包埋剂将OCT包埋的组织固定在样品夹头上。待OCT包埋剂完全凝固后，将夹头固定至样品头。以10–50 µm的步进开始切片，直至达到目标组织深度或器官切面。
4. 当获得理想的组织横截面后，开始以12 µm厚度收集切片。使用艺术家用毛笔轻轻操作切片，并将其转移至特氟龙涂层载玻片上。
5. 将ITO涂层载玻片在组织切片上轻轻滚动，从特氟龙涂层载玻片上拾取组织。通过用手掌按压ITO涂层载玻片背面，使组织切片在载玻片上自然解冻贴附。持续解冻直至组织切片由半透明转变为不透明/哑光质地。
6. 将贴有组织的载玻片置于干冰上，转移至含有干燥剂的干燥箱中，用于当天分析；如需长期保存，则应存放于-80 °C环境中。

3. 非感染对照与C. difficile感染小鼠盲肠组织的制备，用于基质涂布及基质辅助激光解吸电离成像质谱分析

1. 进行MALDI基质点样（喷嘴温度30 °C，8次循环，流速0.1 mL/min，CC模式，干燥时间0 s，压力10 psi）。
2. 进行基质辅助激光解吸电离成像质谱分析
3. 分析多个生物学重复的离子图像，并比较结果以评估显著性 通过 使用上述 SCiLS 统计软件进行强度箱线图比较。
   注意： 适当的统计检验和比较方法取决于具体应用，可包括空间分割、分类模型以及用于确定具有区分性和相关性光谱特征的比较分析。比较分析可包括分配 p-值以识别显著特征，进行组织比较的主成分分析，并绘制箱线图以识别变异。还可通过观察经染色的组织切片的明场显微图像来可视化组织形态 通过 苏木精和伊红（H&E）&E）在成像质谱分析后进行。这有助于清晰识别组织中的形态学特征，并可与经过培训的病理学家共同进行分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 μm Titan3 尼龙注射器滤器	Thermo Scientific	42225-NN
1,5-二氨基萘 MALDI 基质	Sigma Aldrich	2243-62-1
20 mL Henke Ject 鲁尔锁注射器	Henke Sass Wolf	4200.000V0
275i 系列对流真空计	Kurt J. Lesker 公司	KJL275807LL
配备 Smartbeam II Nd:YAG MALDI 激光系统（2 kHz，355 nm）的 7T solariX FTICR 质谱仪	Bruker Daltonics
乙酸溶液，适用于 HPLC	Sigma Aldrich	64-19-7
乙腈，适用于 HPLC，梯度级，≥99.9%	Sigma Aldrich	75-05-8
氢氧化铵溶液，含 28% NH3 的 H2O，≥99.99% 痕量金属级	Sigma Aldrich	1336-21-6
可高压灭菌的生物危害袋：55 加仑	Grainger	45TV10
生物危害样本运输袋（8 英寸 × 8 英寸）	Fisher Scientific	01-800-07
脑心浸液肉汤	BD Biosciences	90003-040
C57BL/6 雄性小鼠	Jackson Laboratories
CanoScan 9000F Mark II 照片与文档扫描仪	Canon
CM 3050S 研究型冷冻切片机	Leica Biosystems
干燥柜	Sigma Aldrich	Z268135
金刚石尖刻划笔，Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific	50-254-51
Drierite 干燥剂颗粒	Drierite	21005
乙醇，200 证明	Decon Labs	2701
flexImaging 软件	Bruker Daltonics
ftmsControl 软件	Bruker Daltonics
玻璃真空捕集器	Sigma Aldrich	Z549460
HTX M5 TM 机器人喷雾器	HTX Technologies
氧化铟锡（ITO）涂层显微镜载玻片	Delta Technologies	CG-81IN-S115
连接至真空泵的在线 HEPA 过滤器	LABCONCO	7386500
甲醇，HPLC 级	Fisher Chemical	67-56-1
MTP 载玻片适配器 II	Bruker Daltonics	235380
最佳切割温度（OCT）包埋剂	Fischer Scientific	23-730-571
Peridox RTU 孢子杀灭剂、消毒剂和清洁剂	CONTEC	CR85335
聚四氟乙烯（PTFE，特氟龙）印刷载玻片，Electron Microscopy Sciences	VWR	100488-874
旋片式真空泵 RV8	Edwards	A65401903
Tissue-Tek Accu-Edge 一次性高剖面切片机刀片	Electron Microscopy Sciences	63068-HP
透明真空管	Cole Palmer	EW-06414-30
Ultragrade 19 真空泵油	Edwards	H11025011
可变电压变压器	Powerstat
水，适用于 HPLC	Sigma Aldrich	7732-18-5
广口杜瓦瓶	Sigma Aldrich	Z120790