评估抑制剂对菌膜形成的影响 枯草芽孢杆菌

摘要

来源：Bucher, T., 等. 以B. subtilis生物膜为模型研究小分子生物膜抑制剂的方法学。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了一种利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）进行的菌膜形成检测方法，用于评估可干扰基质合成及生物膜发育的小分子抑制剂，从而建立一种筛选化合物的模型，这些化合物可选择性抑制表面附着生长，而不影响浮游细胞的生长。

方案

1. 评估小分子抑制剂对浮膜和生物膜菌落形成的影响

1. 制备不含氯化钙和六水合三氯化铁的2倍浓度定义型生物膜诱导MSgg（谷氨酸钠-甘油）培养基。过滤除菌后，加入氯化钙。该培养基可直接使用，或避光保存于4 °C。
2. 在实验当天配制1x MSgg稀释液。
   1. 将2x MSgg培养基用无菌蒸馏水稀释至1x（用于菌膜形成）或用无菌3%热（80 °C）琼脂稀释至1x（用于生物膜形成），并加入六水合三氯化铁，使其终浓度为50 μM（菌膜）或250 μM（生物膜）。根据需要加入抗生素或小分子抑制剂至目标浓度，并充分混匀。例如，为在30 ml培养基中获得0.5 mM的D-亮氨酸终浓度以诱导菌膜或生物膜形成，需加入196.6 µl的76.3 mM（10 mg/ml）D-亮氨酸储备液。
      注意： 最终的1x MSgg成分如以下所述 表1与原始配方相比，该培养基含有 50 µg/ml 苏氨酸，并将铁浓度提高至原来的 2.5 倍，以在固体 MSgg 培养基上促进生物膜菌落的生长，优化皱褶菌落形态。
3. 琼脂凝固后，在接种前将固体MSgg平板置于生物安全柜中干燥30–45分钟。
4. 选择可干扰菌膜形成机制的特异性抑制剂（图1），排除所用浓度对浮游生长和静态生长产生影响的可能性。
   1. 通过每小时测量600 nm处的光密度，直至进入稳定生长期，绘制简单的生长曲线以确定浮游生长情况（液体培养中光密度随时间的增加）。
   2. 为确认所测得的培养物浊度代表活细胞数量，需从振荡培养物中在多个时间点测定浮游生长阶段细胞的菌落形成单位（CFU）数量。
   3. 为评估小分子抑制剂对静态菌膜生长的影响，从在23 °C培养3天后的24孔细胞培养板中收集细胞，该培养条件与1.7–1.9节所述条件相同，并测定CFU。该对照应使用缺乏编码胞外基质组分操纵子的菌膜缺陷型菌株（即, B. subtilis ΔepsH，ΔtasA).
      注意： 该菌株能够在静置条件下生长，但与能够形成菌膜的野生型菌株不同，其漂浮至液-气界面的能力存在缺陷，而液-气界面因氧气含量较高更有利于生长。因此，这种细胞外基质和菌膜缺陷型菌株是评估静置条件下生长情况的推荐参考菌株。
      注意： 对于下文所述的非经典D型氨基酸D-亮氨酸，已排除其在干扰菌膜形成浓度下对浮游生长和静态生长的影响。测定浮游生长和静态生长的方法已详细描述。
5. 划线分离 B. subtilis 来自-80 °C保存的菌种（10 μL LB培养物）⁹ 以无菌枪头或接种棒将细胞涂布于含20%甘油的LB-1.5%琼脂平板上，以分离单菌落。
6. 30 °C过夜培养。
7. 关键步骤： 为了通过非经典D-氨基酸（如D-亮氨酸）实现稳定的菌膜抑制，从LB-1.5%琼脂平板上挑取单菌落，接种于3 ml LB液体培养基中，在37 °C摇床（转速200 rpm）中培养4小时。接种前，将预培养物转移至离心管中，取1.5 ml菌液在6,000 × g条件下离心4分钟，小心弃去上清液，并将菌体沉淀重悬于1.5 ml生物膜诱导MSgg培养基中。剩余培养物可丢弃。重要提示：为确保实验系统的稳定性，需在600 nm处测定菌液的光密度（OD₆₀₀洗涤后的起始培养物的光密度值（OD）应在0.6至1.0之间。
8. 在启动培养物生长期间，准备一个12孔细胞培养多孔板，每孔含有3 ml MSgg培养基，不含或含有一系列浓度的小分子抑制剂例如，0.3、0.5、1 mM D-亮氨酸）。为排除边缘效应，应将不同浓度处理组在多孔板中的位置进行分散分布。或者，可使用含有1.5 ml MSgg培养基的24孔细胞培养多孔板。
9. 将3 µl洗涤后的起始培养物（1:1,000稀释）接种至12孔细胞培养多孔板的各孔中。
   注意： 较低的稀释比例， 即，1:500 的比例可以使用，这会缩短菌膜的形成时间。
10. 在23 °C下静置培养菌膜三天。在此期间不要移动菌膜，以免影响菌膜最终的表面形态。
11. 使用双目显微镜并以均匀的照明条件拍摄闪电图像。或者，使用高分辨率相机拍摄薄层样品图像。为避免因光照角度不一致和阴影造成的伪影，应将相机固定在三脚架上，从正上方进行拍摄，并在两侧以45°角使用柔和且大面积的光源。
    注意： 研究的替代方法 B. subtilis 多细胞性的检测方法是在固体生物膜诱导型MSgg培养基上进行的生物膜菌落实验。与浮膜类似，该实验可用于研究时空动态过程。在确定小分子抑制剂的有效作用范围后，可进一步研究其对生物膜菌落形成的影响。
12. 为培养生物膜菌落，使用模板在干燥的MSgg 1.5%琼脂平板上对称点样1.5 µl未洗涤的预培养液（步骤1.7），每个直径8.5 cm的培养皿点4滴。待液滴完全吸收后再移动平板。
    注意： 该模板有助于在细胞生长区域内实现生物膜菌落的均匀分布。制备模板时，按实际尺寸绘制出整个生长区域，将其划分为面积相等的扇形区域，并标记中心点。对于直径为8.5 cm的圆形培养皿，每个扇形区域的面积约为14 cm²。² 到一个生物膜菌落。
13. 在30 °C下孵育平板三天。在此期间，生物膜菌落发育并形成三维皱褶结构。
14. 按照步骤1.11进行拍照。

表1. 本研究中使用的最终1x MSgg培养基成分。

1.925 mM	磷酸二氢钾
3.075 mM	磷酸氢二钾
100 mM	3-(N-吗啉代)丙磺酸，pH 7.1
2 mM	六水氯化镁
700 μM	无水氯化钙
50 μMa	六水氯化铁(III)
125 μMb
1 μM	无水氯化锌
2 μM	盐酸硫胺素
50 μg/ml	色氨酸
50 μg/ml	苯丙氨酸
50 μg/ml	苏氨酸
0.5% (v/v)	无水甘油
0.5% (w/v)	L-谷氨酸单钠盐水合物
a用于菌膜检测；b用于生物膜检测

结果

图1. 用于确定稳健实验体系以评估生物膜形成特异性抑制作用的概念示意图。筛选小分子抑制剂的选择标准，旨在识别能够特异性干扰生物膜形成、但对浮游生长无显著影响的化合物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB培养基，Lennox	Difco	240230
磷酸二氢钾	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G
磷酸氢二钾	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
3-(N-吗啉代)丙磺酸	Fisher Scientific, 209.27 g/mol	BP308-500
六水合氯化镁	Merck, 203.30 g/mol	1.05833.0250
无水氯化钙	J.T. Baker, 110.98 g/mol	1311-01
四水合氯化锰(II)	Sigma, 197.91 g/mol	31422-250G-R
六水合氯化铁(III)	Sigma, 270.30 g/mol	F2877-500G
无水氯化锌	Acros Organics, 136.29 g/mol	424592500
盐酸硫胺	Sigma, 337.27 g/mol	T1270-100G
L-色氨酸	Fisher Scientific, 204.1 g/mol	BP395-100
L-苯丙氨酸	Sigma, 165.19 g/mol	P5482-100G
L-苏氨酸	Sigma, 119.12 g/mol	T8625-100G
无水甘油	Bio-Lab Itd	712022300
L-谷氨酸单钠盐水合物	Sigma, 169.11 g/mol	G1626-1KG
D-亮氨酸	Sigma, 169.11 g/mol	855448-10G
无水乙醇	Gadot	830000054
37 °C 摇床	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
离心机	Eppendorf 台式离心机 5424	NA
30 °C 培养箱	Binder	NA
23 °C 培养箱	Binder	NA