来源： Bucher, T., 等．用于研究枯草芽孢杆菌生物膜以表征小分子生物膜抑制剂的方法学．J. Vis. Exp. (2016)．
本视频通过比较未经处理和经抑制剂破坏的生物膜中的菌落形成单位，演示了生物膜基质完整性如何影响细菌对乙醇的耐受性。经抑制剂处理的样本中菌落形成单位减少，表明胞外基质对于保护生物膜内细菌细胞免受抗菌应激至关重要。
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方法文章
评估生物膜基质完整性的乙醇抗性检测
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2026年2月26日
本文内容
摘要
方案
1. 乙醇抗性检测
- 在30 °C条件下培养生物膜，生长68小时后，借助剃刀刀片和模板将生物膜菌落切割成大小相等的两部分。
- 用小刮勺小心地将生物膜菌落的每一半从琼脂平板上取下，并转移至含有500 µl磷酸盐缓冲液（PBS）的1.5 ml微量离心管中。如有必要，将平板上残留的细胞刮下，并一同转移至微量离心管中。
注意： 生物膜菌落的后半部分根据其为对照组或用于检测对灭菌剂抗性的情况而进行不同处理。 - 对照组将生物膜菌落的另一半置于500 µl PBS中孵育。为评估对消毒剂的抗性，将生物膜菌落的另一半转移至500 µl 50%（v/v）乙醇中。
注意： 可以使用次氯酸钠等替代性灭菌剂。对于所使用的各种灭菌剂，均需通过预实验确定其有效浓度及孵育时间。 - 将生物膜菌落于室温下在实验台放置孵育10分钟。
- 将生物膜菌落以18,000 x g离心5分钟，并 仔细地 用移液器吸除上清液。加入 300 µl 的 PBS。
- 使用超声波破碎仪的微探头对细胞进行温和超声处理（振幅10%，脉冲5秒）。
注意： 超声能量必须足以分散生物膜聚集体，但过强的超声可能导致细胞裂解。应预先通过光学显微镜确认所使用的超声能量不会引起细胞裂解，且所有聚集体均已溶解。 - 加入700 µl PBS至终体积为1 ml。进行系列稀释（至10-7在PBS中稀释，并用无菌玻璃珠将100 µl的3个稀释度分别涂布于LB-1.5%琼脂平板上。
注意： 应通过预实验确定最佳涂布稀释度，因为这取决于目标生物膜菌落中的细胞数量以及细胞对灭菌剂处理的存活率。 - 30 °C 过夜培养平板，计数菌落形成单位（CFU）并确定 CFU/ml。根据每个半生物膜菌落的最终 CFU/ml 计算存活率百分比。
注意： 当按照所述方法进行操作和分析时，对照生物膜菌落的两个半部分以及未经处理与经乙醇处理的半部分，其活细胞计数差异应低于10%，分别验证菌落的对称性或抗性。 alternatively，结果也可用总CFU表示。对照组和未经处理的生物膜菌落的细胞计数应保持在同一数量级。相比之下，经小分子处理的生物膜菌落中乙醇处理半部分的细胞计数预期至少下降两个数量级，方可表明其对灭菌剂的敏感性增加。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LB培养基，Lennox | Difco | 240230 | |
| 细菌琼脂 | Difco | 214010 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| 磷酸氢二钾 | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-吗啉代)丙磺酸 | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| 六水合氯化镁 | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| 无水氯化钙 | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| 四水合氯化锰(II) | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| 六水合氯化铁(III) | Sigma, 270.30 g/mol | F2877-500G | |
| 无水氯化锌 | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
| 盐酸硫胺 | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
| L-色氨酸 | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
| L-苯丙氨酸 | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
| L-苏氨酸 | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
| 无水甘油 | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
| L-谷氨酸单钠盐水合物 | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-亮氨酸 | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
| 无水乙醇 | Gadot | 830000054 | |
| 剃须刀片 | Eddison | NA | |
| 圆形纤维素滤纸 | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
| 戊二醛 | EMS (Electron Microscopy Science), 水溶液25% | 16220 | |
| 多聚甲醛 | EMS, 水溶液16% | 15710 | |
| 二甲胂酸钠 | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| 二水合氯化钙 | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
| 37 °C 摇床 | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| 离心机 | Eppendorf 台式离心机 5424 | NA | |
| 数字超声波破碎仪，型号250，配双阶梯微探头 | Branson | NA | |
| 30 °C 培养箱 | Binder | NA | |
| 23 °C 培养箱 | Binder | NA | |
| 过滤系统，500 ml，聚苯乙烯 | Cornig Incorporated | NA | |
| 旋转摇床 - Orbitron Rotatory II | Boekel | NA |
