用于形态学分析的细菌生物膜菌落制备

摘要

来源：Bucher, T., et. al., 利用枯草芽孢杆菌生物膜模型研究小分子生物膜抑制剂的方法学。J. Vis. Exp.(2016)

本视频演示了用于高分辨率成像的成熟细菌生物膜菌落的制备过程。内容涵盖固定、脱水、封片及金属镀膜等步骤，以保存并观察生物膜的形态结构。

方案

用于扫描电子显微镜的生物膜菌落样品制备

1. 培养细菌生物膜菌落。
2. 在100 mM 二甲胂酸钠、5 mM 氯化钙缓冲液（pH 7.3）中配制新鲜的2%（v/v）戊二醛和3%（v/v）多聚甲醛固定液。每直径8.5 cm的培养皿准备5 ml固定液。
   注意：戊二醛和多聚甲醛具有危害性。应在化学通风橱内佩戴安全防护设备操作。废弃溶液及被污染的材料应作为危险废物处理。
3. 小心地将固定液加入生物膜菌落中，避免直接滴加在生物膜表面。
   注意：由于生物膜菌落具有疏水性，菌落会缓慢从琼脂表面脱离并开始漂浮。
4. 用Parafilm封口膜小心密封培养皿。在室温下置于旋转摇床上孵育2小时，随后将培养皿转移至4 °C过夜。
5. 次日，使用连接真空泵的巴斯德吸管小心移除液体。
6. 小心加入10 ml 100 mM 二甲胂酸钠、5 mM 氯化钙缓冲液以洗涤生物膜，孵育5分钟。使用玻璃巴斯德吸管从培养皿角落轻轻吸去液体，避免损伤生物膜，然后轻柔地加入新鲜洗涤液。重复此步骤一次。
7. 对生物膜菌落进行脱水处理，按以下步骤进行：2次，每次5分钟，ddH₂O；2次，每次20分钟，30%乙醇；2次，每次20分钟，50%乙醇；2次，每次20分钟，70%乙醇；2次，每次20分钟，96%乙醇；2次，每次30分钟，100%乙醇。
   1. 每步为每个直径8.5 cm的培养皿加入15 ml液体，并在每次孵育后小心移除液体。
8. 采用以下两种方法之一对乙醇中的样品进行干燥。
   1. 乙醇中空气干燥法：
      1. 将一张直径为9 cm的纤维素滤纸剪成四等份。将其中一份短暂浸入100%乙醇中，然后小心地将一个漂浮的生物膜菌落转移至该滤纸上。将湿润的滤纸放入铺有滤纸的培养皿中。盖上培养皿，置于化学通风橱中过夜干燥。
9. 在电子显微镜样品台表面贴上碳导电胶带。使用镊子小心地将生物膜菌落转移至样品台上。使用碳胶带在每个菌落与样品台之间建立细小的连接桥，这对于在电子束照射下消除电荷积累至关重要。此时应小心操作生物膜菌落，因其极为脆弱。将样品置于干燥器中至少保存24小时，或直至检测前。
10. 检测当天，使用扫描电子显微镜（SEM），在金-钯溅射镀膜仪中以60°角溅射镀膜2分钟。重复此步骤两次，每次之间将样品旋转120°。最后，从正上方对样品进行一次3分钟的溅射镀膜。约20 nm厚的金-钯镀层可提高样品导电性，并增强扫描电子显微成像时的对比度。
11. 将样品保存在干燥器中，避免在进行扫描电子显微镜成像前发生再水化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水甘油	Bio-Lab Itd	712022300
无水乙醇	Gadot	830000054
剃刀刀片	Eddison	NA
圆形纤维素滤纸	Whatman, 90 mm	1001-090
戊二醛	EMS (Electron Micoscopy Science)，水中25%	16220
多聚甲醛	EMS，水中16%	15710
二甲胂酸钠	Merck, 214.05 g/mol	8.2067
二水合氯化钙	Merck, 147.02 g/mol	1172113
铝制样品台（带槽头）	EMS	75230
碳导电胶带	EMS	77825-12
37 °C 摇床	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
30 °C 培养箱	Binder	NA
23 °C 培养箱	Binder	NA
旋转摇床 - Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 溅射镀膜仪	Edwards	NA
环境扫描电子显微镜	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA