利用食源性细菌建立斑马鱼幼鱼肠道感染模型

摘要

来源：Flores, E., et al．利用原生动物尾草履虫作为食物传播感染斑马鱼幼虫的载体．J. Vis. Exp. （2019）．

本视频演示了通过喂食感染了荧光标记大肠杆菌（E. coli）的草履虫，在斑马鱼幼鱼中建立食源性细菌性肠道感染模型的方法。

方案

1. 食源性感染斑马鱼
   1. 将细菌与孵育 草履虫.
      1. 制备共培养体系 Paramecium caudatum 和 大肠杆菌 MG1655 感染前夜。将 8 mL E3 培养基、1 mL 正在培养的四膜虫培养物和 1 mL 的 E. coli MG1655 菌液（OD₆₀₀ = 1.0) 重悬于 T25 组织培养瓶中的 1× E3 溶液中，在室温（RT）孵育过夜。每种处理条件准备两瓶草履虫。
      2. 用无菌接种环从平板上挑取单个细菌菌落，接种于细菌培养基（LB（Lysogeny Broth）：1 g/L 胰蛋白胨、0.5 g/L 酵母提取物、1 g/L NaCl）中。将液体培养物于37 °C孵育，并以每分钟110转（rpm）的转速振荡过夜。
         注意： 应穿戴个人防护装备（实验服和手套），并在处理感染性物质时使用生物安全二级设施。
      3. 第二天，测定OD值₆₀₀ 过夜培养物的体积。计算在11 mL培养基中重悬后达到OD600为1所需的培养物体积。
      4. 通过在 6,000 x g 条件下离心收集菌体 g 5分钟，每个草履虫培养瓶加入等体积。弃去上清液，将细菌沉淀重悬于1 mL E3培养基中。
      5. 可选地，用荧光染料对细菌进行预染色。
         1. 加入1 µL FM 4-64FX细菌染料（5 mg/mL储存液）。用铝箔包裹管子以避光，于室温（RT）旋转孵育15分钟。
         2. 通过用1x E3洗涤去除多余的染料：离心收集细菌沉淀 通过 6,000 × 离心 g 孵育1.5分钟，然后将沉淀重悬于1 mL E3培养基中。重复洗涤步骤两次。
         3. 收获染色后的细菌 通过 6,000 × 离心 g 5 分钟后弃去上清液，将细菌沉淀重悬于 1 mL E3 培养基中。
      6. 向两份新鲜草履虫培养物中各加入 1 mL 细菌悬液。室温孵育 2 h。
         注意： 若处理染色后的细菌，需在室温下避光孵育2小时
2. 洗涤细菌/草履虫共培养物
   1. 将两瓶草履虫/细菌共培养物的内容物合并至一个50 mL锥形管中。以300 x g离心样品 g 在15 °C下离心10分钟。确保离心机在此步骤前已预冷。
   2. 用血清移液管移除约10 mL E3上清液，并向锥形管中加入约10 mL新鲜的1x E3。
      注意： 在所有洗涤步骤中，去除上清液时必须迅速操作，因为草履虫会开始从沉淀中游出。每次仅对一个离心管进行离心并去除上清液，以确保此步骤操作足够迅速，避免草履虫随上清液丢失。
   3. 离心样品 通过 在15 °C下以300 × g离心5分钟。使用血清移液管移除约10 mL E3上清液，并向锥形管中加入约10 mL新鲜的1× E3溶液。重复此步骤两次。
   4. 以 300 x 离心样品 g 在15 °C下离心5分钟。小心移除约10 mL E3上清液，注意不要扰动沉淀。
   5. 将沉淀重悬于剩余的10 mL E3培养基中，取500 µL悬液转移至新的1.5 mL微量离心管中。以300 x g离心，沉淀500 µL的草履虫。 g 5分钟内计数草履虫的数量。
   6. 从500 µL样品中移除400 µL E3上清液。向剩余的100 µL草履虫中加入20 µL 36.5%甲醛溶液，轻轻重悬，并在22 °C孵育5分钟。
      注意： 此步骤可杀死草履虫，以便进行计数。
   7. 使用移液器测量实际总体积并记录。用0.4%台盼蓝溶液将草履虫悬液按1:1体积比稀释。
   8. 使用细胞计数器或血细胞计数板对每毫升死亡草履虫的数量进行计数。
      注意： 由于先前的固定步骤，大多数草履虫此时已经死亡，但该数值反映的是共孵育实验中活草履虫的数量。作者未发现细菌共孵育会导致草履虫死亡率显著增加，因此在此可忽略其作为影响因素。
3. 共孵育 草履虫 和斑马鱼幼体
   1. 计算50 mL锥形管中草履虫的浓度
   2. 计算达到 2 x 10 浓度所需的洗涤后草履虫体积⁵ 每毫升草履虫数在3 mL E3培养基的最终体积中。
      注意： 可根据所需的细菌剂量调整草履虫的浓度，该剂量需进行优化。
   3. 用含有100 mM Tris（pH 8.0）的溶液配制终浓度为100 mg/L的三卡因（tricaine）麻醉液，将斑马鱼麻醉。将10条斑马鱼转移至6孔板的每个孔中，每孔总体积为3 mL，其中含有适当浓度的草履虫的新鲜E3培养液。转移幼鱼时应尽量减少携带的液体量，以确保其在受体孔中恢复麻醉状态。
   4. 在光照条件下，于30 °C昼夜培养箱中孵育2小时，以确保捕食所需的最佳光照条件。
   5. 将斑马鱼转移至含有3 mL新鲜E3培养液（含100 mg/L三卡因）的新孔中，重复换液至少5次。
      注意： 切勿在清洗步骤中省略三卡因。在未麻醉状态下转移活动的幼体，会增加对动物造成损伤和痛苦的风险。
   6. 可选步骤：将斑马鱼置于黑色壁的6孔板中，用3 mL 1%低熔点琼脂糖包埋，以备成像。低熔点琼脂糖用1×E3溶液配制，并在微波炉中加热至融化。待琼脂糖完全熔化后，加入三卡因（tricaine），使其终浓度为160 mg/mL。在体视显微镜下，使用剪去尖端的加样枪头将斑马鱼调整至头部朝左、尾部朝右的位置（图1等待5分钟使琼脂糖凝固，然后在包埋的斑马鱼上覆盖含160 mg/mL三卡因的1× E3溶液，用于成像。

结果

图1：斑马鱼的细菌定植。 5天大的斑马鱼未被感染（A），或定植表达mCherry的（B）E. coli 或（C）Salmonella enterica。感染实验可在野生型（A 和 B）斑马鱼或转基因品系（例如在（C）中显示表达绿色荧光中性粒细胞的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Paramecium caudatum，活体	Carolina	131554	培养物不得在室温以下储存
0.4% 台盼蓝溶液	Sigma	T8154-20ML	液体，经无菌过滤，适用于细胞培养；溶于0.81%氯化钠和0.06%磷酸氢二钾中
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	276855-100ML	储存于溶剂安全柜中
Escherichia coli，MG1655	ATCC	ATCC 700926	可用其他非致病性大肠杆菌菌株替代
FM 4-64FX 染料	Thermo Fisher	F34653	分装后冷冻保存
甲醛	Sigma	F8775-4X25ML
LB 肉汤	Sigma	L3397-1KG
磷酸盐缓冲液片剂	Thermo Fisher	18912014
四环素	Sigma	87128-25G	有毒，具刺激性
三卡因（间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，Tricaine）	Sigma	E10521-10G
曲拉通 X-100	Sigma	X100-100ML
台盼蓝溶液，0.4%	Sigma	93595-50ML
UltraPure 低熔点琼脂糖	Thermo Fisher	16520050
血细胞计数板或细胞计数仪	任意
体视显微镜	任意
台式离心机
微波炉
旋转摇床
加热振荡培养箱
水生生物设施
繁殖用培养缸