使用电化学反应器构建细菌单层生物膜

摘要

来源：Tokunou, Y. et. al., 电化学检测重氢动力学同位素效应对Shewanella oneidensis MR-1胞外电子传递的影响。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了一种电化学反应器模型的组装与操作，该模型旨在模拟电极表面生物膜的形成。通过可控的电化学刺激促进微生物黏附，从而逐步形成细菌单层生物膜。

方案

1. 三电极电化学反应器的构建（图1）
   1. 将掺铟氧化锡（ITO）基底作为工作电极置于反应器底部。
   2. 随后插入玻璃圆筒（直径2 cm）和聚四氟乙烯（PTFE）盖子，再将银/氯化银（Ag/AgCl）（饱和氯化钾，KCl）和铂丝分别作为参比电极和对电极插入反应器中。
      注意：为防止空气和溶液泄漏，各组件之间应插入丁基橡胶垫片。
   3. 向电化学反应器中加入4.0 mL添加了10 mM乳酸盐和0.5 g/L酵母提取物的定义培养基（DM）。
   4. 确认电化学反应器无泄漏后，通入氮气超过20分钟，以维持反应器内的厌氧条件。
      注意：为防止其他微生物污染，气体在通入电化学反应器前应经过滤处理。
   5. 将电化学反应器连接至电化学工作站，并对ITO电极施加+0.4 V（相对于标准氢电极，SHE）的电位，同时使用外部水循环系统将反应器温度维持在30 °C。
      注意：为避免外部电场干扰，电化学反应器应置于法拉第笼中。
2. 施氏假单胞菌S. oneidensis MR-1细胞的电化学培养（图1和图2）
   1. 用添加了10 mM乳酸盐和0.5 g/L酵母提取物的DM培养基，将步骤1.1获得的菌悬液调整至600 nm处的光密度为1.43（OD₆₀₀）。
      注意：为准确测定OD₆₀₀，在将菌悬液调整至OD₆₀₀ = 1.43之前，应使用OD₆₀₀ ≤ 0.8的菌悬液进行紫外-可见分光光度计测定。
   2. 用注射器通过进样口向电化学反应器中加入0.3 mL菌悬液，使反应器内OD₆₀₀达到0.1。
      注意：将0.3 mL、OD₆₀₀ = 1.43的菌悬液加入含有4.0 mL培养基的电化学反应器中，最终溶液体积为4.3 mL，OD₆₀₀ = 0.1。若使用不同体积的反应器，需重新计算接种菌液浓度。
   3. 继续对ITO电极施加+0.4 V（相对于SHE）电位，持续25小时。
      注意：为在ITO电极表面形成单层生物膜，应确保产生的电流与图2所示结果的偏差小于50%。

结果

图1：本研究中使用的电化学反应器。 电化学池在组装前（a）和组装后（b）的照片。（c）在相对于标准氢电极（SHE）+0.4 V条件下进行25小时电化学接种后的电化学反应器示意图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃圆筒	N/A	N/A	定制，用作电化学反应器
聚四氟乙烯（PTFE）盖板和底座	N/A	N/A	定制，用作电化学反应器的盖子和基座
丁基橡胶	N/A	N/A	定制，在电化学反应器各组件之间插入使用
隔垫（Septa）	GL Science	3007-16101	用作电化学反应器的进样口
氧化铟锡（ITO）电极	GEOMATEC	No.0001	用作工作电极，5Ω/sq
氯化银/银（Ag/AgCl）饱和KCl电极	HOKUTO DENKO	HX-R5	用作参比电极，Φ0.30 mm
铂丝	The Nilaco Cooporation	PT-351325	用作对电极
LB培养基（Luria-Bertani Broth, Miller）	Becton, Dichkinson and Company	244620	用于S. oneidensis MR-1的预培养
细菌用琼脂（Bacto agar）	Becton, Dichkinson and Company	214010
NaHCO₃	Wako	191-01305	用于定义培养基（DM）
CaCl₂·2H₂O	Wako	031-00435	用于DM
NH₄Cl	Wako	011-03015	用于DM
MgCl₂·6H₂O	Wako	135-00165	用于DM
NaCl	Wako	191-01665	用于DM
2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）	DOJINDO	346-08235	用于DM
乳酸钠溶液	Wako	195-02305
酵母提取物（Bacto yeast extract）	Becton, Dichkinson and Company	212750
重水（D, 99.9%）	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-4-PK	用于动力学同位素效应实验的添加剂
培养箱	TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.	LTI-601SD	用于预培养
摇床	TAITEC	NR-3	用于预培养
高压灭菌器	TOMY SEIKO CO. LTD.	LSX-500	用于电化学反应器和培养基的灭菌
超净工作台	SANYO	MCV-91BNF	用于防止其他微生物污染电化学反应器和培养基
离心机	Eppendorf	5430R	要求转速可达6000×g
氮气发生器	Puequ CO. LTD.	PNTN-2	也可使用氮气钢瓶替代气体发生器
紫外-可见分光光度计	SHIMADZU	UV-1800	用于优化细胞密度
电化学工作站	BioLogic	VMP3	用于生物膜形成和动力学同位素效应实验
恒温水浴循环器	AS ONE	TR-1A	用于维持电化学反应器的温度
法拉第屏蔽笼	HOKUTO DENKO	HS-201S	用于电化学实验