利用GFP标记的SKN-1可视化病原体诱导的C. elegans氧化应激

摘要

来源： Naji, A., 等研究由Mitis群引起的氧化应激 链球菌 在 秀丽隐杆线虫. 视频实验杂志 (2019)

本视频展示了利用表达绿色荧光蛋白标记的SKN-1的秀丽隐杆线虫（C. elegans），通过检测绿色荧光来监测氧化应激水平。将线虫暴露于 S. gordonii 显示强烈的核荧光，证实病原体诱导的应激反应，而饲喂的 E. coli 在细胞质中显示弥散的绿色荧光，表明SKN-1激活程度极低。

方案

1. 观察 SKN-1 在响应特定刺激时的定位变化 链球菌 gordonii 感染

1. 在每块接种了链球菌（Streptococcus）的Todd–Hewitt酵母提取物（THY）培养基和每块接种了大肠杆菌（Escherichia coli）（E. coli）的线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上，分别加入约100条L4期幼虫。每种细菌菌株使用三块平板。于25 °C培养2至3小时。
2. 随后，将平板从培养箱中取出，用改良M9缓冲液（M9W）冲洗，并将线虫收集至15 mL锥形管中。
3. 将线虫洗涤3次。
4. 通过抽吸去除大部分M9W，然后向线虫沉淀中加入500 µL含有2 mM叠氮化钠或2 mM盐酸四咪唑的M9W。这将使线虫麻醉，确保在显微镜下观察时无任何运动。
   注意：操作叠氮化钠时需使用个人防护装备（PPE）。叠氮化物溶液应在化学通风橱中配制。
5. 将线虫沉淀在室温（RT）下孵育15分钟。然后，取15 µL线虫悬液滴加到预先制备的琼脂糖垫上。轻轻将一块1.5号盖玻片覆盖在含有麻醉线虫的琼脂糖垫上。
6. 使用荧光显微镜，通过异硫氰酸荧光素（FITC）和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）滤光片观察Skinhead家族转录因子1或SKN-1:GFP（绿色荧光蛋白标记的SKN-1）的定位情况。以10倍和20倍放大倍数对线虫进行成像。
7. 根据SKN-1的定位水平对线虫进行评分。无核定位、SKN-1B/C::GFP（绿色荧光蛋白标记的SKN-1亚型B/C）在线虫前部或后部定位、以及SKN-1B/C::GFP在所有肠细胞中发生核定位，分别归类为低、中、高水平的定位。
8. 完成荧光显微图像评分后，使用统计学软件通过卡方检验和Fisher精确检验确定统计学差异。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养基与化学试剂
BD Bacto Todd Hewitt 肉汤	Fisher Scientific	DF0492-17-6
15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管	Fisher Scientific	12-565-269
叠氮化钠	Sigma Aldrich	S2002-25G
盐酸四咪唑	Sigma Aldrich	L9756
1.5 号 18 mm × 18 mm 盖玻片	Fisher Scientific	12-541A
琼脂糖	Sigma Aldrich	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell