制备小鼠口咽部吸入模型以建立细菌性肺部感染

摘要

来源：Nielsen, T. B., et al., 呼吸机相关性和医院获得性细菌性肺炎的小鼠口咽部吸入模型。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了通过口腔咽部将细菌递送至麻醉小鼠肺部以诱导肺部感染并触发免疫反应的操作步骤。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 接种/感染小鼠

1. 将麻醉后的小鼠用一根结实的细绳悬挂，使其上门齿钩住绳子例如，牙线）固定在距离地面约两倍小鼠体长高度的固定物体上（例如，20 cm）高于操作台面（例如，实验台。
2. 使用无菌的钝头镊子轻轻将小鼠的舌头从其口腔中拉出。将舌头转移至戴有无菌手套的手指上，以防止意外压伤小鼠舌头。将舌头保持在口腔外，以便暴露口咽部，并防止接种物被吞咽至一侧。
3. 在固定小鼠舌头的同时，使用微量移液器将50 μL接种物（细菌悬液）注入其口咽部；口咽部位于口腔与咽部交界处，靠近口腔后方。
   注意： 使用微量移液器加样时，必须仅将液体加至移液器的第一停点。当接种物被置于小鼠口咽部时，小鼠会短暂停止呼吸数秒；随后，通过反射性吸入作用，小鼠将吸入细菌悬液，此时可听到液体进入肺部时特有的爆裂音，从而导致肺炎感染。
4. 如果接种物未放置到足够靠后的位置以阻塞正常呼吸，则用镊子夹住鼻孔，迫使动物通过口腔产生反射性吸气，从而吸入接种物。
5. 接种后，松开舌头，将小鼠从悬挂绳上取下，放入笼中，并监测直至其从麻醉状态中苏醒。

2. 监测疾病进展

注意：由于动物可能遭受痛苦，应使用多种指标来判断小鼠是否进入濒死状态；一旦确定小鼠濒死，应根据先前批准的IACUC方案实施安乐死；濒死状态的多种标志包括体温、体重减轻、外观、步态以及可通过血液检测获得的其他生物标志物（e.g., 通过iSTAT检测）。

1. 根据已批准的 IACUC 方案对小鼠实施安乐死（e.g., CO₂ 吸入后行颈椎脱位）。
2. 切断靠近肺组织的气管、肺动脉和肺静脉，从小鼠体内取出肺组织。
   1. 显微镜检查
      1. 将肺组织（或部分组织）放入样本模具中。
      2. 向样本模具中加入最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂，完全浸没组织。
      3. 将样本在 -80 °C 下冷冻。
      4. 将样本送至病理学实验室进行切片并贴附于载玻片上，用于显微镜观察。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉用腔室	Kent Scientific Corporation	VetFlo-0720	最多可容纳5只小鼠
冷冻模具，中等尺寸	Sakura Tissue-Tek	4566	一次性乙烯基标本模具，15×15×5 mm
牙线	Oral-B	37000469537	系于距实验台高度约6英寸的稳固柱上
镊子	VWR	82027-440	用于轻柔地将小鼠舌头拉出口腔
异氟烷（用于麻醉）	Abbott	10015516	可使用其他替代药物；请相应调整操作步骤
iSTAT 检测卡	Abbott	03P79-25	提供多种型号卡盒以满足不同需求
氯胺酮，100 mg/mL	Western Medical Supply	4165	用PBS稀释10倍至1 mg/mL，并与浓度为1 mg/mL的赛拉嗪混合使用
眼部药膏	Akorn	Tears Renewed	避免药膏管尖接触眼睛
磷酸盐缓冲液（PBS）	Corning	21-031-CM	不含钙和镁的Dulbecco's PBS
移液器吸头，200-μL	VWR	10017-044	使用前需高压灭菌
移液器，200-μL	Gilson	Pipetman P200	使用前需高压灭菌并校准
细菌涂布棒	Bel-Art	F377360006	每次使用前需通过烘烤或高压灭菌进行灭菌
冻存管，2.0 mL	Corning	430659	用于高浓度细菌接种物的低温保存