利用光敏剂前体进行光激活治疗细菌生物膜

摘要

来源： Zhao, K., et al. 一种体外模型用于研究5-氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法对Staphylococcus aureus生物膜的影响。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了一种光动力疗法方案，用于评估对革兰氏阳性菌生物膜的抗菌效果。将生物膜分为四组：其中两组接受光敏剂前体处理，另两组接受缓冲液处理。所有组均在避光条件下孵育，随后对其中一组前体处理组和一组仅含缓冲液的组进行红光照射。只有同时接受前体和光照的组才会产生活性氧，从而导致细菌细胞死亡。通过比较各组的存活率，评估治疗效果。

方案

1. 生物膜形成

1. 在96孔微孔板中形成生物膜
   1. 取保存在 -80 °C 的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌株 USA300 以及3株形成生物膜的临床菌株（C1-C3）。
      注意：临床菌株形成生物膜的能力已通过微量滴定板法测定。
   2. 将细菌接种于5 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中，在37 °C条件下振荡培养过夜，至稳定生长期。
   3. 将过夜培养的细菌在25 °C下以4,000 × g离心10分钟，弃去上清液。用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬菌体沉淀，调整终浓度为2.0 × 10⁹ 菌落形成单位（CFU）/mL。
      注意：细菌浓度通过测定光密度估算，并进一步通过平板计数法确定，结果显示悬浮液中1 OD₆₀₀ 相当于1.5 × 10⁸ CFU/mL。
   4. 将细菌悬液用含0.5%葡萄糖的TSB培养基稀释1:200（即1.0 × 10⁷ CFU/mL）。向经细胞培养处理的聚苯乙烯96孔微孔板的每孔中加入200 µL细菌悬液。
   5. 将微孔板置于充分供氧环境中，于37 °C静置培养24小时。
      注意：不同细菌菌株形成成熟生物膜所需的培养时间可能不同；应在进行光动力疗法（PDT）实验前确定最佳培养时间。
   6. 弃去各孔中的培养基，用PBS轻柔洗涤微孔板各孔三次，随后弃去上清液。
      注意：此步骤应操作轻柔，避免扰动已形成的生物膜。

2. 光照照射

1. 将5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）储存于4 °C冰箱中。实验前，用PBS将5-ALA稀释至10 mM。
   注意：5-ALA溶液应在实验前新鲜配制。
2. 在实验组中，向微孔板的每个孔中加入200 µL 10 mM ALA，或向培养皿中加入2 mL。用铝箔包裹微孔板或培养皿，孵育1小时。然后使用发光二极管（LED）以100 mW/cm²的光强照射微孔板或培养皿1小时，主波长为633 ± 10 nm，以达到360 J/cm²的光剂量。
   注意：为确保光能有效且均匀地传递至所有孔或培养皿中的生物膜，需将光源峰值与孔/皿之间的距离固定为6.0 cm，并将实验区域限制在中央照射区域（10 cm × 8 cm）。为保证实验结果的可重复性，实验应在相同的室温条件下进行。在LED照射步骤中，为避免微孔板或培养皿直接暴露于其他光源（如日光、室内照明或灯光），应在将微孔板或培养皿移至照射区域前先打开LED，且光线应足够明亮以完成操作。
3. 设置对照组（本实验设置了三个对照组）。
   1. 第一对照组（ALA-LED-）：向微孔板的每个孔中加入200 µL PBS，或向培养皿中加入2 mL。用铝箔包裹微孔板或培养皿，孵育2小时。
   2. 第二对照组（ALA+LED-）：向微孔板的每个孔中加入200 µL 10 mM ALA，或向培养皿中加入2 mL。用铝箔包裹微孔板或培养皿，孵育2小时。
   3. 第三对照组（ALA-LED+）：向微孔板的每个孔中加入200 µL PBS，或向培养皿中加入2 mL。用铝箔包裹微孔板或培养皿，孵育1小时。然后将微孔板或培养皿暴露于主波长为633 ± 10 nm、光剂量为360 J/cm²的LED照射下。
      注意：在LED照射步骤中，避免微孔板或培养皿直接暴露于其他光源，如日光、室内照明或灯光。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）	OXOID	CM0129B
SYTO9	Thermo Fisher Scientific	L7012	LIVE/DEAD BacLight 细菌活性检测试剂盒
碘化丙啶（PI）	Thermo Fisher Scientific	L7012	LIVE/DEAD BacLight 细菌活性检测试剂盒
5-氨基乙酰丙酸（ALA）	复旦张江生物医药	3.1
Staphylococcus aureus 菌株 USA300			USA 300 参考菌株
Staphylococcus aureus 临床菌株（C1-C3）			所有临床菌株均分离自慢性鼻窦炎患者
96孔微孔板	Corning 公司	3599	透明平底聚苯乙烯组织培养处理微孔板，独立包装，带盖，无菌
Eppendorf 微型离心机 5417	Eppendorf	Z365998 | SIGMA
培养箱	Thermo Fisher Scientific	SHKE4000	MaxQ 4000 台式轨道摇床
发光二极管（LED）	武汉雅阁光电技术有限公司	LED-IB