荧光标记细菌的样品制备与成像

摘要

来源： Chetrit, D., 等结合活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统 视频实验杂志. (2020).

本视频展示了荧光标记致病菌的制备与成像过程。首先制备琼脂糖垫并将其置于粘性框架内。将表达荧光蛋白的基因工程细菌悬液滴加到琼脂糖垫上，以固定细胞。随后用盖玻片密封框架，并在显微镜下观察，以获取细菌的荧光图像。

方案

注意：所有涉及L. pneumophila的培养、操作和成像步骤均应在符合当地规定的生物安全二级实验室中进行。

1. 利用等位基因交换和双重筛选策略将sfGFP插入嗜肺军团菌染色体（图1，图2）

1. 将以下序列克隆到基因替换载体 pSR47S11 中：目标位点上游 1,000 bp 的序列，随后是 sfGFP 序列，然后是目标位点下游 1,000 bp 的序列（图 1）。sfGFP 序列应通过包含四至八个氨基酸的连接子，与目标蛋白的 N 末端或 C 末端保持阅读框一致。将构建好的载体转化至 Escherichia coli DH5αλpir 中。随后，在含有 100 µg/mL 链霉素的活性炭-酵母提取物（CYE）琼脂平板上划线接种 L. pneumophila（受体菌），于 37 °C 培养 5 天（图 2）。
2. 在 CYE-琼脂-链霉素平板上划线接种 L. pneumophila，于 37 °C 培养 2 天（形成浓密菌斑）。在含有 25 µg/mL 氯霉素的 LB 琼脂平板上划线接种携带 pRK600 辅助质粒（辅助菌）的 E. coli DH5α。在含有 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 琼脂平板上划线接种 E. coli DH5αλpir（供体菌）。
3. 进行三亲杂交：将一株辅助菌、一株供体菌和受体菌的菌落共同接种，在无选择压力的 CYE 琼脂平板上重叠培养三种菌株，于 37 °C 孵育 4–8 小时。作为阴性对照，将辅助菌与受体菌混合、供体菌与受体菌混合，同样条件下孵育相同时间。
4. 用 500 µL 的 ddH₂O 重悬杂交反应物。取 20 µL 和 50 µL 反应液涂布于含有 100 µg/mL 链霉素和 10 µg/mL 卡那霉素的 CYE 琼脂平板上，于 37 °C 培养 5 天。挑取其中四个转化子，在含有 100 µg/mL 链霉素的 CYE 琼脂平板上划线，于 37 °C 培养 5 天。
5. 将 16 个克隆在含有 5% 蔗糖和 100 µg/mL 链霉素的 CYE 琼脂平板上划线，于 37 °C 培养 5 天。随后，从这些克隆中挑取 32 个，分别在含有 100 µg/mL 链霉素的 CYE 琼脂平板以及含有 100 µg/mL 链霉素和 10 µg/mL 卡那霉素的 CYE 琼脂平板上划线，于 37 °C 培养 5 天。

2. 将sfGFP整合到L. pneumophila染色体中的克隆的分离

1. 将对卡那霉素敏感的克隆划线接种于CYE-琼脂-链霉素平板上，通过菌落聚合酶链式反应（PCR）确认sfGFP已插入染色体。使用与sfGFP基因及目标染色体区域互补的引物，扩增插入位点的连接区域。
   1. 取0.5 µL的10 µM引物溶液各一种，并加入一个菌落，加水至终体积12.5 µL，于95 °C变性10分钟。冰上冷却10分钟后，加入12.5 µL的2x PCR预混液，进行PCR分析。
2. 将分离的菌落在CYE-琼脂-链霉素平板上密集划线，于37 °C培养2天。使用抗GFP抗体通过免疫印迹检测sfGFP融合蛋白的表达水平和稳定性。

3．表达荧光标记 Dot/Icm 组分的 L. pneumophila 活细胞成像

1. 琼脂糖垫的制备
   1. 在玻璃烧瓶中配制约30 mL的1%低熔点琼脂糖水溶液，微波加热约90秒，期间偶尔摇动，直至琼脂糖完全溶解。
   2. 将两个22 × 22 × 0.15 mm³的玻璃盖片叠放在一个25 × 75 × 1.1 mm³载玻片的一侧边缘，另一侧边缘同样叠放另外两个22 × 22 × 0.15 mm³的玻璃盖片。
   3. 用移液器吸取约1 mL熔融琼脂糖，注入上下两片盖片之间的中心载玻片区域，然后将另一张25 × 75 × 1.1 mm³的载玻片轻轻覆盖在熔融琼脂糖上，尽量避免产生气泡。将载玻片置于4 °C冷却15分钟。
   4. 使用解剖刀或剃须刀片，将凝固的琼脂糖垫轻轻切割成约5 × 5 mm²的小方块。将一个17 × 28 × 0.25 mm³的双面胶粘框架固定在25 × 75 × 1.1 mm³的载玻片上，并将多个琼脂糖垫放置于其上。
2. 图像采集
   注意：以下步骤适用于由SlideBook 6.0控制、配备固态照明器、CCD黑白相机和100倍物镜（数值孔径1.4）的显微镜系统。如有需要，可使用其他具备适当硬件和软件配置的显微设备，并根据本实验方案的参数进行自定义设置。
   1. 将大量L. pneumophila菌体悬浮于1 mL ddH₂O中，涡旋混匀后取2–3 µL稀释液滴加至琼脂糖垫上。将一块50 × 24 × 0.15 mm³的盖玻片轻轻覆盖在粘性框架上。
   2. 在图像采集界面中将中性密度滤光片（ND）设置为180， binning设为2×2，使用488 nm通道对样品曝光500–1,000 ms。采用相同成像参数对未标记的L. pneumophila进行成像，以验证荧光信号的特异性（图3）。

结果

图1：利用同源重组和等位交换将sfGFP插入L. pneumophila染色体的示意图。(A) 三亲接合在含有接合质粒pRK600（IncP型质粒）的E. coli MT616辅助菌株、携带自杀型载体pSR47S的E. coli供...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100x Plan Apo 物镜（1.4 NA）	Nikon
ACES	Sigma-Aldrich	A9758
活性炭	Sigma-Aldrich	C5510
低熔点琼脂糖 GPG/LMP	American bioanalytical	AB00981
Bacto 脱水琼脂	BD	214010
Gene Frame，1.7×2.8 cm，125 µL	Fisher Scientific	AB-0578
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	C7352
显微镜盖玻片 22×22 mm	Fisher Scientific	12-542B
显微镜盖玻片 24×50 mm	Fisher Scientific	12-545K
显微镜载玻片 25×75×1 mm	Globe Scientific	1380
SlideBook 6.0	Intelligent Imaging Innovations
Spectra X 光源引擎	Lumencor
Taq 2X Master Mix	New England BioLabs	M0270
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific
酵母提取物	BD	212750