建立小鼠模型 艰难梭菌 感染

摘要

来源：Winston, J. A., et al. 利用头孢哌酮处理的小鼠模型研究临床相关性 Clostridium difficile 菌株 R20291。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了用抗生素预处理小鼠后接种Clostridium difficile孢子以建立感染小鼠模型的实验步骤，用于研究其致病机制及宿主免疫应答。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 制备 艰难梭菌 孢子接种物与小鼠灌胃

注意：接种 C. difficile 芽孢的小鼠应饲养在生物安全二级动物实验设施中。

1. 获取 C. difficile 所需菌株（此处为 R20291）的孢子储备液，该储备液已用无菌水配制并保存于 4 °C。使用前需测定此孢子储备液的浓度。
2. 根据已知的孢子储备液浓度（孢子数/ml），计算所需稀释倍数，以获得每25 µl含10⁵个孢子的悬液。确保接种液体积足够用于实验中所有小鼠的接种（每只小鼠25 µl）、接种物浓度的计数（约30 µl）以及弥补移液误差。
3. 涡旋原始样本 C. difficile 孢子储备液。然后，重悬步骤1.2中计算出的原始储备液体积 C. difficile 将孢子储存液加入无菌水中，置于带螺旋盖的微量离心管内。在超净工作台中进行有氧操作。将此稀释后的混合液标记为“孢子接种物”。
4. 将孢子接种物放入65 °C水浴中加热20分钟。
   注意： 此步骤将确保仅有活化的 C. difficile 热处理后仍有孢子残留。
5. 在层流罩内，取50 µl加热后的孢子接种物，置于无菌微量离心管中，并将其放入厌氧室。此样品用于孢子计数。
6. 在超净工作台内，将剩余的加热孢子接种物加入连接无菌球头胃饲针头的1 ml注射器中。使用手动注射器推进器，以确保小鼠间给药准确且快速重复。使用前需确保胃饲针头内已充满加热孢子接种物。
   注意： 每只小鼠无需使用新的无菌灌胃针。然而，如果给予不同剂量的 C. difficile 每次给药时应使用新的灌胃针。
   注意： C. difficile 孢子对传统消毒剂具有高度抗性。因此，必须使用杀孢子消毒剂，例如 #62 Perisept 杀孢子消毒剂。制造商建议作用时间为 2 min 以彻底灭活 C. difficile 孢子
7. 用25 µl孢子接种物对每只小鼠进行灌胃。轻轻抓住小鼠颈背部的松弛皮肤以固定动物，使其头部保持不动。用食指进一步固定小鼠头部并拉长食管。在固定过程中，应确保动物不发出叫声或表现出其他痛苦迹象。
   注意： 小鼠灌胃给药的总体积不应超过10 ml/kg体重（0.1 ml/10 g）。
8. 将小鼠保持直立、垂直的姿势，轻轻将灌胃针从口腔侧边插入。沿小鼠口腔顶部引导灌胃针，并缓慢推进至食管。
   注意： 若遇到任何阻力，说明灌胃针可能已进入气管，此时不应继续推进，而应立即拔出并重新放置。
9. 当灌胃针插入食管约一半位置时，注入25 µl加热的芽孢接种物，然后轻柔地将灌胃针从食管中撤出。
   注意： 用力推进灌胃针可能导致食管或胃部破裂。因此，若在推进灌胃针时遇到阻力，应立即撤出并重新调整灌胃针的位置。
10. 将动物放回笼中，并观察其是否有咳嗽或呼吸困难的迹象，因为这可能表明意外将加热的孢子接种物注入气管或发生吸入。
    注意： 小鼠对...极为敏感 C. difficile 抗生素处理后需采取预防措施，防止笼具间的交叉污染，这一点至关重要。在管理经抗生素处理但未进行病原攻击的小鼠作为对照组时，尤其需要注意。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#62 Perisept 杀孢子消毒清洁剂	SSS Navigator	48027	该产品需按照制造商推荐进行稀释
C57BL/6J 小鼠	The Jackson Laboratory	664	小鼠年龄应为 5 - 8 周
2 ml 微型离心管螺口盖	Corning	430917