在感染小鼠模型粪便样本中对Clostridium difficile进行定量分析

摘要

来源：Winston, J. A. 等. 经头孢哌酮处理的小鼠模型感染临床相关性Clostridium difficile 菌株 R20291。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了利用选择性培养技术对感染小鼠模型粪便样本中的Clostridium difficile进行定量分析。内容包括样本采集、厌氧处理、梯度稀释和菌落计数等操作步骤，用于评估细菌定植情况及宿主-病原体相互作用。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 获取样本 艰难梭菌 (艰难梭菌（C. difficile） 计数
   注意： 在采集粪便或盲肠内容物之前，使用分析天平称量无菌微量离心管的重量。将管重记录在管壁上，保留四位小数（例如， 0.9864 g）。将此重量记为“管重”。采集的每个样本应置于无菌且已称重的微量离心管中。
   1. 小鼠粪便的无菌采集
   1. 轻轻抓住小鼠颈部和背部的松弛皮肤以固定动物，使其头部保持不动。用小指轻轻固定动物的尾巴，以暴露肛门。在固定过程中，应确保动物不发出叫声或表现出其他应激迹象。
   2. 将一个已称重的无菌微量离心管直接置于动物肛门下方，注意离心管不可与小鼠直接接触。
      1. 当动物排便时，将粪便颗粒收集到离心管中。所有粪便样本收集完毕前，将离心管置于室温保存。小鼠排便可能需要数分钟，因此需多次尝试收集粪便。
   3. 称量装有粪便的离心管，使用分析天平称重。记录离心管重量，保留四位小数。例如， 1.0021 g）。将所得重量记为“最终管重”。
   4. 在收集粪便样本后，立即将样本送入厌氧室进行细菌计数。
2. 细菌计数 C. difficile
   1. 计算待计数内容物（粪便）的最终重量 C. difficile通过从“离心管重量”中减去“最终离心管重量”来完成此步骤。
   2. 将内容物用1×磷酸盐缓冲液（PBS）进行1:10稀释，并相应地重悬。对于粪便颗粒，使用移液器吸头轻轻将颗粒破坏并分散到溶液中。
   3. 将重悬的样品在室温下厌氧孵育30分钟，使内容物沉淀。
   4. 在1×PBS中对每个样本进行系列稀释，用于定量每克内容物（粪便）中的菌落形成单位（CFU）。该操作需在厌氧条件下进行。
   5. 采用无菌技术，将每种连续稀释液各100 µl转移至牛磺胆酸环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂（TCCFA）平板。使用无菌L型涂布棒将接种于培养基上的稀释液均匀涂布至整个平板表面。均匀涂布对菌落的准确计数至关重要。
   6. 在37 °C下厌氧培养平板24小时。此时，进行计数 C. difficile 菌落以获得每克内容物（粪便）的菌落形成单位（CFU）。 C. difficile 菌落呈扁平状、淡黄色，边缘不规则，具有毛玻璃样外观。
      注意： 本方案可用于计数 C. difficile 从小鼠胃肠道（GI）其他部位的内容物（包括回肠和结肠内容物）中分离。可使用聚合酶链式反应（PCR）板进行系列稀释。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x PBS	Gibco	10010-023
Bacto 琼脂	Becton Dickinson	214010	TCCFA 平板的组成部分（见下文）
Bacto 蛋白胨	Becton Dickinson	211684	TCCFA 平板的组成部分（见下文）
头孢西丁	Sigma	C47856	TCCFA 平板的组成部分（见下文）
2 ml 微型离心管螺口盖	Corning	430917
D-环丝氨酸	Sigma	C6880	TCCFA 平板的组成部分（见下文）
果糖	Fisher	L95500	TCCFA 平板的组成部分（见下文）
磷酸二氢钾	Fisher	P285-500	TCCFA 平板的组成部分（见下文）
硫酸镁（无水）	Sigma	M2643	TCCFA 平板的组成部分（见下文）
Millex-GS 0.22 μm 滤器	Millex-GS	SLGS033SS	TCCFA 平板用滤器
磷酸氢二钠	Sigma	S-0876	TCCFA 平板的组成部分（见下文）
NaCl	Fisher	S640-3	TCCFA 平板的组成部分（见下文）
PCR 板	Fisherbrand	14230244
塑料培养皿	Kord-Valmark 品牌	2900
无菌塑料 L 形涂布棒	Fisherbrand	14-665-230
牛磺胆酸盐	Sigma	T4009	TCCFA 平板的组成部分（见下文）
超纯蒸馏水	Invitrogen	10977-015
C57BL/6J 小鼠	The Jackson Laboratory	664	小鼠年龄应为 5–8 周