基于荧光的巨噬细胞受体与细菌抗原相互作用研究方法

摘要

来源： Barbero, A. M., 等。 用于研究的荧光检测方法 结核分枝杆菌 与免疫受体SLAMF1的相互作用。 J. Vis. Exp. ( (2025)

本视频展示了一种基于荧光的检测方法，用于研究巨噬细胞受体与结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）抗原之间的相互作用。将荧光标记的抗原置于盖玻片上，与巨噬细胞蛋白提取物孵育，经交联、抗体标记后，通过荧光信号的重叠进行观察。

方案

1. 结核分枝杆菌 通过荧光显微镜观察SLAMF1相互作用

1. 细菌-蛋白质交联
   1. 使用圆头手术镊将直径12 mm的圆形盖玻片放入24孔细胞培养板中（每孔1片）。
      注意：使用70%乙醇彻底清洁盖玻片。如需要，可进行高压灭菌或在紫外线下照射30分钟以灭菌。
   2. 在4 °C条件下，用400 µL含10 µg/mL聚-D-赖氨酸（Poly-D-Lysine）的溶液孵育盖玻片过夜。用铝箔包裹培养板以避光。
   3. 次日，从冰箱中取出培养板，用1 mL去离子水清洗盖玻片两次。
   4. 让盖玻片自然干燥。
   5. 将20 µL（2 × 10⁶）Mtb-R Ags加入180 µL的1×PBS中稀释。最终200 µL溶液足以完全覆盖一片盖玻片。
   6. 在细胞培养箱中，37 °C条件下用Mtb-R Ags孵育盖玻片1小时。
   7. 弃去剩余液体，并用1 mL 1×PBS（磷酸盐缓冲液）清洗两次。
      注意：在此步骤中，可使用对应红色荧光通道的滤光片在荧光显微镜下检查Mtb-R是否成功黏附于盖玻片。
   8. 加入400 µL封闭缓冲液（含10%胎牛血清（FBS）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）），在室温下振荡（摇床）孵育30分钟。
   9. 用400 µL封闭缓冲液清洗两次。
   10. 加入100 µL蛋白提取物，并用300 µL 1×PBS稀释，在室温下振荡孵育2小时。
   11. 加入400 µL用1×PBS稀释的1%甲醛溶液，在室温下振荡孵育15分钟。
   12. 加入500 µL用去离子水稀释的0.125 M甘氨酸溶液，在室温下振荡孵育5分钟。
   13. 用1 mL 1×PBS清洗两次。
   14. 加入400 µL用2 mM乙二醇双（琥珀酰亚胺基琥珀酸酯）（EGS）溶液，在室温下振荡孵育1小时。
   15. 重复步骤1.1.13
       注意：建议在使用前即时配制试剂。
2. SLAMF1染色
   1. 用石蜡膜包裹细胞培养板的盖子。
   2. 在覆盖有石蜡膜的盖子上滴加60 µL已预先滴定好的抗SLAMF1一抗（1:75稀释）。
   3. 使用弯头精细手术镊和针头小心地从培养板中取出盖玻片。
      注意：为便于取出盖玻片，可将针头弯曲至约45°角。
   4. 将盖玻片倒置覆盖在含有抗体的液滴上，在室温下避光孵育30分钟。
   5. 抬起盖玻片，用封闭缓冲液清洗两次。
   6. 将盖玻片倒置覆盖在新的含有二抗（1:200稀释）的液滴上，在室温下避光孵育30分钟。
   7. 重复步骤1.2.5。
   8. 去除多余液体，将盖玻片置于载玻片上的封片液滴中进行封片。
   9. 使用合适的滤光片在荧光显微镜下观察。
      注意：建议在无菌条件下操作。抗体应使用封闭缓冲液稀释。操作盖玻片时需小心，避免产生划痕影响显微镜观察。强烈推荐使用适用于荧光成像的封片液。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 二抗	Invitrogen	A21121	用于荧光显微镜检测
抗 SLAMF1 一抗	BioLegend	306302	用于荧光显微镜检测
Aqua-Poly/Mount 封片剂	Polysciences	18606-20	封片介质
12 mm 盖玻片	HDA	-	用于显微镜下的相互作用检测
EGS	ThermoFisher Scientific	21565	用于交联处理
甲醛	Merck	K47740803613	用于交联处理
载玻片	Glass Klass	-	用于显微镜下的相互作用检测
甘氨酸	Sigma	G8898	用于交联处理
Imager.A2	Carl Zeiss	430005-9901-000	配备 Colibri 7 照明模块的荧光显微镜
聚-D-赖氨酸	Sigma Aldrich	A-003-M	用于盖玻片处理
罗丹明 B	Sigma Aldrich	21955	用于 M. tuberculosis 染色