利用微灌胃法建立斑马鱼幼鱼感染模型

摘要

来源： Li, J., 等 建立幼年斑马鱼感染模型 艰难梭菌（Clostridioides difficile） 视频实验杂志 (2020).

本视频演示了显微灌胃操作，其中将麻醉后的斑马鱼幼体固定在琼脂糖中，并使用示踪剂引导的针头经口注入致病菌。这种非侵入性递送方式模拟了自然感染过程，可用于分析细菌增殖、毒素释放以及肠道上皮损伤。

方案

1. 斑马鱼幼鱼灌胃

1. 校准微量灌胃针。
2. 将微量矿物油滴加到校准载玻片上，并将针尖置于其上，测量针尖直径。确保针尖直径为 30–40 µm，末端钝化且表面光滑。丢弃尖锐或粗糙的针头。
   注意：可通过快速火焰灼烧钝化针头的锋利边缘。
3. 制备灌胃溶液。
4. 将针头装填并固定到显微操作仪上。
5. 调节显微操作仪，使针头呈 45° 角定位。
6. 对斑马鱼幼鱼进行麻醉。当幼鱼停止活动后，使用巴斯德吸管将其转移至微量灌胃模具的凹槽中。
7. 在斑马鱼幼鱼上滴加一滴 0.8% 低熔点琼脂糖，使其覆盖幼鱼。轻轻调整幼鱼位置，使其头部朝上呈 45° 角，尾部紧贴凹槽壁。确保所有幼鱼头部角度大致相同，以便与灌胃针的角度对齐。将微量灌胃模具置于冰上 30–60 秒，使低熔点琼脂糖凝固，从而稳定幼鱼的位置。
8. 调节注射压力至 200–300 hPa，设定注射时间为 0.1–0.3 秒，以注入 3–5 nL 的 Clostridioides difficile。
9. 轻柔操作针头穿过琼脂糖，进入斑马鱼幼鱼的口部，并沿食道推进。当针尖到达前肠膨大部时，踩下注射踏板释放细菌，使注入的液体充满肠腔。注意避免液体从食道或泄殖腔溢出。注射完成后，轻柔地将针头从幼鱼口中撤出。
10. 灌胃结束后，使用柔性微加载吸头先切开琼脂糖，再小心提起幼鱼，将其从琼脂糖中取出。将幼鱼转移至无菌的 30% Danieau's 溶液中，用无菌培养基清洗两次。随后将幼鱼转移至新的 10 cm 培养皿中。幼鱼将在受精后最多维持培养至 11 天（dpf）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A2576	超低凝胶点琼脂糖
低熔点琼脂糖（LM）	Pronadisa	8050	用于琼脂糖平板
毛细玻璃管	Harvard Apparatus	30-0019	注射针头
Clostridioides difficile			R20291，一种027型核型菌株，可产生TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIJI	开源平台		图像处理
HEPES	Carl Roth GmbH	6763
水平针拉制仪	Sutter instrument Inc	P-87
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	168149
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		图像处理
显微注射仪	eppendorf	5253000017
显微注射模具	Adaptive Science Tools	TU1
Leica SP8 共聚焦显微镜	Leica
酚红	Sigma-Aldrich	P0290
氯化钾（KCl）	Carl Roth GmbH	5346
氯化钠（NaCl）	Carl Roth GmbH	9265
牛磺胆酸盐	Carl Roth GmbH	8149
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
酵母提取物	BD Bacto	212750