通过真空渗透法将细菌病原体接种至Arabidopsis叶片中

摘要

来源：Rufián, J. S., 等. 植物组织内 Pseudomonas syringae 基因表达的单细胞分析. J. Vis. Exp. (2022)

本视频演示了一种通过真空渗入法将细菌病原体导入拟南芥（Arabidopsis）植物叶片的方法。该方法利用制备好的细菌悬浮液和真空脉冲，使细菌通过气孔均匀进入，从而实现对叶片感染的可控操作。

方案

1. 拟南芥植株的接种

注意： 在本研究中，菌株 Pseudomonas syringae 丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000及 P. syringae pv. phaseolicola 1448A 被使用。

1. 制备 P. syringae 接种物
   1. 划线接种 P. syringae 从−80 °C甘油保藏菌种中挑取目标菌株，接种于添加适当抗生素的LB平板（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物、16 g/L细菌琼脂）上。在28 °C培养40–48 h。
      注意： 如果目标菌株携带质粒或基因组抗性基因，建议使用抗生素。推荐的抗生素浓度如下： P. syringae 如下：卡那霉素（15 µg/mL）、庆大霉素（10 µg/mL）、氨苄青霉素（300 µg/mL）。
   2. 刮取细菌生物量，并重悬于 5 mL 10 mM MgCl 中₂. 测定OD值₆₀₀ 通过加入 10 mM MgCl 将其调节至 0.1₂.
      注意： OD₆₀₀ 0.1 的 P. syringae 培养物相当于 5 x 10⁷ CFU·mL⁻¹.
   3. 将样品进行连续稀释至10 mM MgCl中₂ 以达到终浓度为 5 x 10 的接种量⁵ CFU·mL⁻¹. 准备200 mL的接种物用于 拟南芥 植物
   4. 接种前，将表面活性剂Silwett L-77加入至终浓度为0.01% 拟南芥请注意，Silwett 对某些情况略有不利影响 拟南芥 组织
2. 进行真空渗透。
   1. 对于 拟南芥 浸润时，在花盆上放置两根木棍呈X形 （图1E），将花盆倒扣在含有200 mL接种液、直径为14 cm的培养皿上 （图 1F）.
   2. 将浸入接种液中的植物放入真空室中 （图1G） 施加500 mbar的脉冲压力，持续30秒，以浸润叶片。重复抽真空脉冲2-3次，直至叶片完全浸润。 （图 1H）.
   3. 用一张纸吸去多余的接种液，然后将植物放回相应的生长室。

结果

图1： 细菌接种与叶际提取方法 拟南芥 植物。A) 金属网正确安装后的花盆制备。B) 使用牙签按照 ( 中所示方式撒播种子C). (D) 拟南芥 准备接种的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
140 mm 培养皿			无特殊要求
细菌学琼脂	Roko
硫酸庆大霉素	Duchefa	G-0124
硫酸卡那霉素	Phytotechnology	K378
MgCl₂	Merk
NaCl	Merk
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
胰蛋白胨	Merk
真空室，直径 25 cm	Kartell	554
真空泵	GAST	DOA-P504-BN
酵母提取物	Merk
氨苄青霉素钠	GoldBio