高通量细胞内成像 布鲁氏菌 abortus 宿主上皮细胞感染

摘要

来源： 卡萨诺瓦，A. 等基于显微镜的高通量筛选参与宿主因素的检测方法 布鲁氏菌 Hela细胞感染 视频实验杂志 (2016)

本视频展示了利用siRNA介导的STING基因敲低技术，对上皮细胞中布鲁氏菌（Brucella abortus）感染进行高通量成像，以研究胞质DNA感应在胞内细菌复制及宿主先天免疫反应中的作用。

方案

1. 感染与固定

1. 感染前一天，将确定量的B. abortus起始菌种接种于250 ml螺口瓶中的50 ml TSB/Km（含50 µg/ml卡那霉素的胰蛋白胨大豆肉汤）培养基中。用封口膜密封瓶子，并在37 °C、100 rpm的摇床中过夜培养细菌，使其OD₆₀₀达到0.8–1.1。
2. 测定细菌培养物的OD₆₀₀，并通过将菌液用DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）/10% FCS（胎牛血清）稀释，配制感染用培养基，以获得所需的感染复数（MOI）。
   注意：为在HeLa细胞中实现5–10%的感染率，使用MOI为10,000。应针对每种细胞类型进行MOI滴定实验，以获得最佳感染率。
3. 使用自动板洗机将384孔板中的转染培养基更换为50 µl感染培养基。
4. 将384孔板在400 × g、4 °C条件下离心20分钟。
   注意：此步骤有助于同步感染过程。
5. 用封口膜密封板子，并将其置于预热的铝板上，在37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育4小时。
6. 使用含100 µg/ml庆大霉素（Gm）的DMEM/10% FCS通过自动板洗机洗涤细胞（使用每孔200 µl的溢流洗涤），以灭活细胞外细菌。
   注意：在溢流洗涤过程中，自动板洗机会同时分配和抽吸培养基。
7. 对于入胞实验，使用含100 µg/ml Gm和100 ng/ml aTc的DMEM/10% FCS，通过自动板洗机对细胞进行第二次洗涤（使用每孔200 µl的溢流洗涤）。
8. 用封口膜密封板子，并将其放回预热的铝板上，在37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中继续孵育，终点实验孵育40小时，入胞实验孵育4小时。
9. 固定时，使用自动板洗机以PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤各孔（使用每孔200 µl的溢流洗涤）。
10. 使用自动板洗机将PBS更换为50 µl pH 7.4的0.2 M HEPES溶液中含3.7%多聚甲醛（PFA）的固定液。
    注意：注意：PFA吸入、皮肤接触或吞咽均有毒性。
11. 室温孵育20分钟。
12. 使用自动板洗机将固定液更换为50 µl PBS。 
    注意：若需要，样品现在可移出BSL3实验室。
    警告：从生物安全三级（BSL3）设施中移出任何样品均需进行风险评估并验证操作程序，且须符合适用的生物安全法规。

2. 染色

1. 用 50 µl PBS 洗涤细胞两次。
2. 加入 50 µl 含 0.1% Triton-X-100 的 PBS，室温孵育 10 分钟以通透细胞。
3. 用 PBS 洗涤细胞三次。加入 20 µl 含 1 µg/ml DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的 PBS，室温避光孵育 30 分钟。
4. 用 PBS 洗涤细胞三次，并用铝箔包裹以避光保护染色样本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic Soy Broth, TSB）	Fluka	22092
硫酸卡那霉素	Sigma-Aldrich	60615
250 ml 螺口瓶	Corning	8396
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
胎牛血清（Fetal Calf Serum, FCS）	Gibco	10270	经热灭活处理
Greiner CELLSTAR 384 孔板	Sigma-Aldrich	M2062
可剥离铝箔封口膜	Costar	6570
试剂分配仪：“Multidrop 384 Reagent Dispenser”	Thermo Scientific	5840150	可使用其他型号的试剂分配仪。
转染试剂：“Lipofectamine RNAiMAX”	Invitrogen	13778-150
自动板洗仪：“Plate washer ELx50-16”	BioTek	ELX5016	该洗板仪配备适用于384孔板的16通道歧管，可置于生物安全柜内操作，且在洗涤过程中配有盖板以减少气溶胶的产生风险。也可使用具备类似功能的其他洗板仪。
庆大霉素	Sigma-Aldrich	G1397
PBS	Gibco	20012
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	溶于0.2 M HEPES缓冲液（pH 7.4）中。-20 °C保存，使用前一天新鲜解冻。注意：PFA吸入、皮肤接触或吞咽均有毒性。
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
吐温-100（Triton X-100）	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI	Roche	10236276001
Kif11 siRNA	Dharmacon	L-003317-00
ARPC3 siRNA	Dharmacon	L-005284-00
Brucella abortus 2308
HeLa CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	Molecular Devices	IXM IMAGING MSCOPE	配备精密电动Z轴的自动化细胞成像显微镜。也可采用其他自动化显微成像系统，以及下文所述的其他软硬件组件。