使用受激拉曼散射显微镜检测细菌对抗生素的敏感性

摘要

来源：Zhang, M. 等，通过受激拉曼散射成像检测单个细菌中氘掺入实现快速抗菌药物敏感性测试。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了利用受激拉曼散射显微技术，通过追踪氘标记的代谢活性来评估细菌对抗生素的敏感性。通过监测碳–氘信号，该方法能够快速检测耐药和敏感细菌群体。

方案

1. 抗生素存在下的D₂O掺入处理（图1a）

1. 使用分光光度计在600 nm波长下测量光密度（OD），以检测细菌浓度。
2. 使用不含氘的普通穆勒-欣顿肉汤（MHB）培养基稀释细菌溶液，使最终细胞浓度达到8 × 10⁵ CFU/mL。轻轻涡旋以混匀细菌细胞。
3. 将细菌溶液分别分装为七管每管300 µL，以及一管600 µL，均置于1.5 mL微量离心管中。
4. 向含有600 µL细菌溶液的微量离心管中加入4.8 µL抗生素（庆大霉素或阿莫西林）储备液（1 mg/mL），使最终抗生素浓度为8 µg/mL。
5. 从含8 µg/mL抗生素的细菌溶液中取出300 µL，加入另一管含300 µL细菌溶液的管中，制备两倍稀释的抗生素（4 µg/mL）细菌溶液。
6. 对测试抗生素（庆大霉素或阿莫西林）进行连续两倍系列稀释，直至达到最低浓度（0.25 µg/mL）的微量离心管，并从该管中弃去300 µL。对于庆大霉素和阿莫西林，系列浓度范围均为0.25 µg/mL – 8 µg/mL。
   1. 保留一管不加抗生素作为空白对照。该管将作为阳性对照，用于检测在不含抗生素但含D₂O处理条件下细菌的代谢活性。
   2. 保留一管既不加抗生素也不含D₂O，作为阴性对照。
7. 将含特定抗生素（庆大霉素或阿莫西林）的MHB培养基中的细菌分装液在37 °C、200 rpm振荡培养箱中孵育1小时。
8. 在孵育期间，使用含100% D₂O的培养基，按照步骤1.6中制备的相同抗生素浓度梯度，准备抗生素的系列稀释液。对于庆大霉素和阿莫西林，系列浓度范围均为0.25 µg/mL – 8 µg/mL。
9. 抗生素处理1小时后，将系列稀释的抗生素与含100% D₂O的MHB培养基各700 µL，分别加入300 µL经相同浓度抗生素预处理的细菌溶液中（该溶液在步骤1.6中制备）。
   1. 例如，将700 µL含8 µg/mL抗生素的100% D₂O-MHB培养基加入300 µL经8 µg/mL抗生素预处理的细菌溶液中。依此类推，将相应浓度的培养基转移至对应浓度的细菌管中，并通过反复吹打数次以混匀。
   2. 将700 µL不含抗生素但含100% D₂O的MHB培养基加入300 µL不含抗生素的细菌溶液（在步骤1.6.1中制备）中，作为空白对照。
   3. 在37 °C、200 rpm振荡培养箱中继续孵育30分钟。
      注意：在此步骤中，测试体系中D₂O的最终浓度为70%。
10. 首先将1 mL经抗生素和D₂O处理的细菌样品在4 °C下以6200 × g离心5分钟，然后用纯化水洗涤两次。最后将样品固定于10%福尔马林溶液中，并在4 °C下保存。

2. 单个细菌中D₂O代谢掺入的受激拉曼散射（SRS）成像

1. 用1 mL纯化水洗涤固定后的细菌溶液，然后以6200 x g离心 g 4 °C下离心5分钟。弃上清液。将细菌溶液浓缩至约20 µL。
2. 将细菌溶液滴加到聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，夹心封装样品用于SRS成像。
3. 使用SRS显微镜在2168 cm-1的C-D振动频率下对细菌进行成像。
   1. 使用计算机上的控制软件将泵浦波长输入并调节至852 nm。
   2. 使用功率计测量激光功率。通过调节激光输出端前的半波片，将泵浦激光在样品处的功率设为约8 mW，拉曼激光在样品处的功率设为约40 mW。
      注意： 在SRS显微镜中，一台重复频率为80 MHz的可调谐飞秒激光器提供泵浦光（680至1300 nm）和斯托克斯光（1045 nm）激发激光。
4. 通过调节反射镜的螺丝，对泵浦光束和斯托克斯光束进行空间准直，并将两束光导入配备有二维振镜系统的直立显微镜，用于激光扫描。
   1. 使用60倍水浸物镜将泵浦激光和斯托克斯激光聚焦于样品上。
   2. 使用油冷凝器从前向收集来自样品的信号。
   3. 使用带通滤光片在将斯托克斯激光导入光电二极管之前将其滤除。
   4. 通过锁相放大器提取受激拉曼信号，并使用光电二极管检测信号。
5. 将每个SRS图像设置为包含200 × 200像素，并在软件控制面板中将像素驻留时间设为30 µs。单幅图像的总采集时间约为1.2 s。设置 步长 至150 nm，因此图像大小约为30 × 30 µm²每个样本至少拍摄三个视野的图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
声光调制	Gooch&Housego	R15180-1.06-LTD	调制斯托克斯激光束
阿莫西林	Sigma Aldrich	A8523-5G
带通滤光片	Chroma	HQ825/150m	在光电二极管前阻断斯托克斯激光束
氯化钙	Sigma Aldrich	C1016-100G	阳离子调节
阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤	Fisher Scientific	B12322	通过肉汤稀释法对微生物进行抗菌药物敏感性试验
离心机	Thermo Scientific	75002542
盖玻片	VWR	16004-318
带卡扣盖的培养管	Fisher brand	149569B
重水		151882	用于溶解抗生素的有机溶剂
氘代重水（d6）	Sigma Aldrich	156914	作为标准品用于校准受激拉曼散射（SRS）成像系统
Escherichia coli BW 25113	The Coli Genetic Stock Center	7636
Eppendorf 聚丙烯微量离心管 1.5 mL	Fisher brand	05-408-129
硫酸庆大霉素	Sigma Aldrich	G4918
亲水性聚偏二氟乙烯滤膜	Millipore-Sigma	SLSV025NB	孔径 5 µm
InSight DeepSee 飞秒脉冲激光器	Spectra-Physics	Model: insight X3	可调谐激光源及固定波长为 1045 nm 的激光源，用于 SRS 成像
锁相放大器	Zurich Instrument	HF2LI	解调 SRS 信号
油浸聚光镜	Olympus	U-AAC	数值孔径 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)	American Type Culture Collection	ATCC 47085
光电二极管	Hamamatsu	S3994-01	探测器
聚丙烯圆锥形离心管 15 mL	Falcon	14-959-53A
聚丙烯滤器	Thermo Scientific	726-2520	孔径 0.2 µm
无菌培养皿	Corning	07-202-031
10 mL 注射器	Fisher brand	14955459
紫外/可见光分光光度计	Beckman Coulter	Model: DU 530	测量 600 nm 波长处的光密度
涡旋混合器	VWR	97043-562
水镜物镜	Olympus	UPLANAPO/IR	60×，数值孔径 1.2