在Drosophila幼虫中建立细菌感染

摘要

来源： Hiroyasu, A., D 等。 从血细胞中提取 黑腹果蝇 用于微生物感染与分析的幼虫 视频实验杂志 (2018)

本视频演示了通过将Drosophila幼虫置于细菌液滴中并用钨针穿刺来建立细菌感染的方法。随后将幼虫培养在带有凹槽的富含营养的琼脂平板上，以研究宿主与病原体之间的相互作用。

方案

1. 体内感染

1. 将 Drosophila 果汁琼脂平板在室温下预热 15 分钟。
   1. 将 30 g 琼脂加入 700 mL 水中，高压灭菌 40 分钟。
   2. 将 0.5 g 对羟基苯甲酸甲酯溶解于 10 mL 无水乙醇中。
   3. 将对羟基苯甲酸甲酯溶液加入 300 mL 果汁浓缩液中。
   4. 迅速将果汁浓缩液混入已高压灭菌的琼脂溶液中，并分装 5 mL 至 10 × 35 mm 的培养皿中。
   5. 平板冷却 15 分钟后，于 4 °C 保存。
2. 准备三龄幼虫。
3. 将酵母膏涂布于琼脂平板上。在琼脂平板上划出细小切口，以便幼虫迁移以避免干燥（图 1A）。使用石蜡膜将 0.001 mm 尖端的钨针固定在持针镊上（图 1B, C）。
4. 在体视显微镜下，将 50 µL 高滴度表达 mCherry 的 Coxiella burnetii（5.95×10⁹ GE/mL）滴加至石蜡膜上，并将幼虫放入细菌液滴中。
5. 将幼虫置于细菌液滴中，用钨针刺穿幼虫（图 3D），然后转移至琼脂平板上（图 1E）。
6. 将剩余的病原体培养基转移至琼脂平板上，并用石蜡膜密封平板。
7. 将幼虫置于湿润空气中培养，直至达到所需的感染后时间点（图 1F）。本实验中，C. burnetii 感染的幼虫在平板上培养 24 小时。

结果

图1: 体内感染 A) 果蝇 果汁琼脂平板和酵母膏用于培养 体内 感染的幼虫。在琼脂平板上划出切口以延长幼虫存活时间（灰色箭头）。B）将直径0.001 mm的尖头钨针用石蜡膜固定在镊子上。C）直径0.001 mm的尖头钨针尖端。D）在体视显微镜下，用钨针在石蜡膜上的病原菌液...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
体视显微镜	Amscope	SM-1BSZ-L6W
镊子	VWR	82027-402
Coxiella burnetii - mCherry	Dr. Heinzen, R.
Drosophila 果蝇培养基平板	Cold Spring Harbor Protocols		http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
琼脂	Fisher Bioreagents	BP1423-500
对羟基苯甲酸甲酯	Amresco	0572-500G
无水乙醇	Fisher Bioreagents	BP2818-500
Welch's 100% 葡萄汁冷冻浓缩液，340 mL	Amazon	B0025UJVGM
培养皿，10 × 35 mm	Fisher Scientific	08-757-100A
酵母，干活性面包酵母	MP Biomedicals	210140001	按体积比将2份水加入1份酵母中
钨针	Fine Science Tools	10130-20
持针钳	VWR	HS8313
Listeria monocytogenes	ATCC	菌株：10403S	Listeria monocytogenes 菌株 10403S（Bishop 和 Hinrichs，1987）在含有 50 µg/ml 链霉素的 Difco 脑心浸出液（BHI）肉汤（BD Biosciences）中，于 30 °C 条件下培养。