从植物中提取的病原体的单细胞基因表达分析

摘要

来源：Rufián, J. S., 等．植物组织内丁香假单胞菌基因表达的单细胞分析．J. Vis. Exp. （2022）．

本视频展示了一种利用荧光标记的转录因子在单细胞水平分析从植物中分离的病原细菌基因表达的方法。共聚焦成像揭示了毒力基因表达的异质性，凸显了克隆细菌群体内的功能多样性。

方案

1. 萋出液细菌的单细胞分析

1. 在蒸馏水中配制1.5%的琼脂糖溶液。待其融化后，取适量体积填充于两片并排放置的显微镜载玻片之间的空隙，并在顶部再覆盖一片载玻片（图1）。静置干燥15分钟，然后小心移除顶部的载玻片。使用刀片在使用前立即将琼脂糖垫切割成5 mm × 5 mm的小片。
2. 同时，将1 mL从质外体提取的细菌在室温下以12,000 × g 离心1分钟，用移液器小心吸除上清液，并将沉淀重悬于20 µL水中以浓缩细胞。取2 µL浓缩后的菌液滴加到一片0.17 mm的盖玻片上，然后用步骤1中制备的5 mm × 5 mm琼脂糖垫覆盖液滴，如图1所示。
3. 在共聚焦显微镜下观察细菌样品（参见材料表）。为识别绿色荧光细菌，使用488 nm激发激光和500 nm至550 nm的发射滤光片。为识别所有细菌，使用明场成像并将明场与荧光图像合并。
4. 使用Fiji软件处理共聚焦图像（参见材料表）。具体操作时，使用MicrobeJ插件识别细菌细胞的轮廓，并测量其内部的荧光强度。
   注意：建议选择孤立（非聚集）的细菌进行图像采集分析。

结果

图1：琼脂垫的设置与制备示意图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.17 mm 盖玻片			无特殊要求
1.6 x 1.6 mm 金属网	Buzifu		玻璃纤维筛网
50 mL 锥形管	Sarstedt
琼脂糖	Merk
共聚焦显微镜 Stellaris	Leica Microsystems
Fiji 软件