体外肠道模型评估细菌黏附与内化

摘要

来源：Calatayud Arroyo, M., et al. 在体外肠道宿主-微生物界面评估合成细菌群落的存活能力。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种用于研究细菌存活性的体外肠道宿主-微生物模型。将经模拟消化条件预处理的细菌与Caco-2和HT29-MTX细胞共培养体系共同孵育。通过跨上皮电阻评估上皮屏障完整性，并收集培养基、溶解黏液、细胞裂解物和细胞碎片等组分用于后续分析。

方案

1. 菌株与培养条件

注意：合成口腔菌群由口腔微生物组中常见的菌株组成。

1. 从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获取以下菌株：Aggregatibacter actinomycetemcomitans（ATCC 43718）、Fusobacterium nucleatum（ATCC 10953）、Porphyromonas gingivalis（ATCC 33277）、Prevotella intermedia（ATCC 25611）、Streptococcus mutans（ATCC 25175）、Streptococcus sobrinus（ATCC 33478）、Actinomyces naeslundii（ATCC 51655）、Streptococcus gordonii（ATCC 49818）、Actinomyces viscosus（ATCC 15987）以及 Streptococcus mitis（ATCC 49456）。
2. 从莱布尼茨微生物与细胞培养物保藏中心（DSMZ）获取 Veillonella parvula（DSM 2007），从BCCM/LMG细菌保藏中心获取 Streptococcus sanguinis（LMG 14657），并使用 Streptococcus salivarius 菌株 TOVE-R 和 Streptococcus oralis。

2. 口腔微生物组代表性多物种群落的构建

注意：构建一个合成菌群以模拟口腔细菌对表面的潜在黏附能力 体外 肠道上皮。在添加了5 μg/mL血红素、1 μg/mL甲萘醌和5%无菌去纤维马血的血琼脂平板上培养细菌。简而言之：

1. 将100 mg血红素溶于2 mL 1 M氢氧化钠（NaOH）中，加入100 mL蒸馏灭菌水。避光容器保存。使用前经0.22 µm滤器过滤除菌后加入培养基。
2. 将100 mg甲萘醌溶解于20 mL 96%乙醇中。过滤除菌（0.22 µm滤器）后加入培养基。
3. 制备1 L血液琼脂培养基（参见 材料表按照说明书操作并进行高压灭菌。待冷却后加入马血和补充剂。混匀后倾注平板。
4. 制备改良脑心浸液（BHI）肉汤。高压灭菌后加入终浓度为5 μg/mL的血红素和1 μg/mL的甲萘醌。
5. 在 Hungate 试管中分装 9 mL 培养基，用橡胶塞和铝盖密封。用氮气/二氧化碳或 N₂/CO₂ 混合气体冲洗试管₂/CO₂ (90%/10%).
6. 用注射器吸取1 mL厌氧培养基，置于1.5 mL微量离心管中。挑取各细菌物种的单菌落，重悬于培养基中，然后转回厌氧改良BHI培养基。除以下物种外，其余均在37 °C培养48 h， S. salivarius，必须孵育24小时。
7. 如有需要，在构建合成菌群前确认培养物的纯度。简要步骤如下：
   1. 从液体培养物中提取DNA，并使用引物27F（AGAGTTTGATYMTGGCTCAG）和1492R（TACGGYTACCTTGTTACGACT）扩增16S rRNA基因，扩增程序如下：95 °C预变性5分钟，随后进行30个循环（95 °C变性1分钟、55 °C退火1分钟、72 °C延伸1.5分钟），最后在72 °C延伸5分钟。
   2. 使用商业试剂盒纯化聚合酶链式反应（PCR）产物（参见 材料表），按照制造商的说明进行操作。
   3. 在含有0.5 μL染料（参见 材料表），3.2 pmol 的 M13f 引物（CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC），2.0 μL 的 5x 测序缓冲液，以及 20 ng 的模板，使用商业测序系统及配套试剂盒（参见 材料表).
      注意：该操作由商业公司完成。
   4. 对所有序列进行BLAST搜索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），以确定最接近的已知分类单元，并使用RDP Classifier在线工具（http://rdp.cme.msu.edu/）和SINA比对服务（https://www.arb-silva.de/aligner/）与原始菌株的序列进行比对。
8. 使用流式细胞术结合SYBR Green/碘化丙啶染色，在孵育结束时测定细胞数量。将培养物稀释至10⁵ 细胞/mL^-1，使用改良的BHI。
9. 加入1 mL的 S. mitis 加入75 mL厌氧BHI中，并培养至稳定期（6 h）。随后，在厌氧条件下收集每种稀释菌株的0.75 mL并混合。
10. 将所有培养物混合后，取1 mL微宇宙体系加入75 mL BHI中。在10% CO₂条件下培养合成菌群₂，10% 氢气（H₂），80% N₂，37 °C、200 rpm 条件下孵育 48 小时（参见 材料表).
11. 按照2.8步骤测量细胞密度，然后将菌群作用于细胞模型。可采用定量实时PCR评估菌群的组成。此外，使用16S rRNA基因扩增子测序以获取初始存在的菌群成员信息。对于任一用于鉴定身份的实验方案，均以cDNA为模板以指示正在活跃转录蛋白的细菌，以DNA为模板以揭示菌株的存在与否。

3. 细胞培养通用操作规范

注意：所使用的细胞系可从英国公共卫生署欧洲认证细胞库（Caco-2 ECACC 86010202 和 HT29-MTX-E12 ECACC 12040401）获取。细胞培养试剂可购买获得（见材料表），除非另有说明。

1. Caco-2 和 HT29-MTX 细胞系的维持与传代 注意：Caco-2 和 HT29-MTX 细胞常规培养于含补充成分的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（表1）的 25 cm² 组织培养瓶中。当细胞融合度达到 60–70% 时进行胰酶消化传代。
   1. 从培养瓶中移除细胞培养基，用不含钙/镁（Ca⁺⁺/Mg⁺⁺）的 PBS 洗涤两次，每次 5 mL。
   2. 加入 2 mL 浓度为 0.5 mg/L 的胰酶溶液和 0.22 g/L 的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。轻轻晃动培养瓶使胰酶溶液分布均匀，随后吸出 1.5 mL 胰酶溶液，并将培养瓶置于 37 °C 培养箱中孵育 10 分钟。
   3. 在显微镜下观察细胞是否已从瓶壁脱落。如需要，可额外继续孵育 5 分钟。
   4. 向培养瓶中加入 5 mL 含补充成分的细胞培养基以终止胰酶消化作用。反复吹打使细胞充分悬浮，获得均一的单细胞悬液。
   5. 立即取 50 µL 细胞悬液，与无菌 0.4% 台盼蓝溶液按 1:1（v/v）比例混合（Caco-2 细胞）或 1:5（v/v）比例混合（HT29-MTX 细胞）。通过移液器吹打混匀后，加入细胞计数板（见 材料表）。
   6. 在显微镜下计数活细胞（明亮的白色细胞）（参见仪器制造商说明书）。
   7. 将细胞以 Caco-2 细胞 4 × 10⁵ 个细胞/cm²、HT29-MTX 细胞 1 × 10⁴ 个细胞/cm² 的密度接种至新培养瓶中。
      注意：(1) Caco-2 细胞在达到融合状态后会自发分化并形成紧密连接。因此，在胰酶消化前必须避免细胞过度融合。若细胞在培养瓶中过度生长，可能导致胰酶消化后细胞无法脱落和/或出现细胞团块。(2) HT29-MTX 细胞为黏液分泌型细胞，具有较高的代谢活性，可能导致培养基快速酸化，尤其是在细胞密度较高时。可在细胞培养基中添加 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液（表1），以维持 pH 在 7 至 7.2 之间。若 pH 下降，且细胞融合度低于 50%，可更换培养基；但若融合度 >50%，则必须进行传代处理。

4. 构建模拟肠道宿主-微生物界面的多区室细胞模型

注意：在双室培养板孔中完成共培养（直径 24 mm，孔径 0.4 μm；参见材料表）。

1. 向顶端室加入1.5 mL完全细胞培养基，向基底室加入2 mL。接种前孵育20–30分钟，以确保细胞悬液分布均匀。
2. 用胰蛋白酶消化Caco-2和HT29-MTX细胞培养物，操作步骤如第3节所述。必须严格遵循胰蛋白酶消化程序，以获得两种细胞系均匀分布、无细胞团块的单细胞悬液。
3. 按照3.1.8节所述方法计数活细胞。
4. 调整细胞密度至 6.5 x 10⁴ 细胞/平方厘米² Caco-2/HT29-MTX 细胞按 90/10 的比例
5. 将细胞悬液充分匀浆，然后加入相应体积的Caco-2和HT29-MTX细胞至已预装含补充物的细胞培养基的无菌容器中。通过抽吸去除培养小室顶端预孵育的培养基。
6. 用移液器轻轻吹打细胞悬液使其混匀，然后取1.5 mL转移至培养小室插入物的顶室。接种过程中需持续保持细胞悬液的均匀性，因为细胞容易发生沉降。根据操作者的经验与操作速度，在分装1–3个孔后即需重新混匀细胞悬液。
7. 轻轻前后移动培养板，然后从右至左再至右（5–10 次），使细胞在孔内均匀分散。转移至培养箱中，并重复上述移动操作。
8. 将Caco-2/HT29-MTX细胞共培养15天，每2天用添加了补充物的DMEM更换顶侧和基底侧培养室中的培养基。此后，细胞培养基可更换为不含抗生素/抗真菌剂溶液的添加了补充物的DMEM。
9. 每隔2天更换一次培养基，持续培养至接种后20–21天。
10. 在开始实验前，使用电阻测量系统（见材料表）按照制造商说明测量上皮屏障的完整性。
    1. 确保跨上皮电阻（TEER）检测设备已充满电（>24 小时）后开始测量。
    2. 将TEER设备从电源断开，并用塑料 autoclave 袋覆盖。在袋上打一个孔以便插入电极，并将电极插入仪表的输入端口。在将TEER设备放入超净工作台前，用70%乙醇/水（v/v）喷洒消毒。
    3. 将电极尖端浸入70%乙醇/水（v/v）溶液中15分钟以消毒。静置晾干15秒。用预热的细胞培养基冲洗电极。
    4. 从培养箱中取出细胞，并在生物安全柜内使细胞恢复至室温。
    5. 确保电表已与充电器断开连接。将模式开关调至欧姆档，并打开电源开关。
    6. 将电极的短端浸入小室中，长端置于孔外，测量细胞电阻。保持电极与板插入物呈90°角。

5. 细菌存活率检测 体外 胃肠道转运条件

注意：所有稀释均需使用超纯水配制。所有溶液均需通过0.22 µm滤膜过滤除菌，并在无菌条件下进行消化处理。

1. 口腔消化：
   1. 将3 mL细菌群落置于50 mL无菌管中，加入3 mL模拟唾液液（SSF），其中含有（单位：mmol L⁻¹）^-1）：氯化钾（KCl），15.1；磷酸二氢钾（KH₂PO₄）₂PO₄)，3.7；碳酸氢钠（NaHCO₃）₃)，6.8；六水合氯化镁 [MgCl₂(H₂O₆]，0.5，碳酸铵[(NH₄) CO₃]，0.06；盐酸（HCl），1.1；二水合氯化钙 [CaCl₂·2H₂O]₂(H₂O₂]，0.75。向SSM中加入75 U/mL的人唾液α-淀粉酶IX-A型和2 g/L猪胃黏蛋白II型。
   2. 在37 °C、100 rpm条件下孵育混合物2分钟。取2 mL样品用于DNA提取及流式细胞术定量分析（S1）。
2. 胃消化：
   1. 加入4 mL模拟胃液（SGF），其成分（单位：mmol L-1）为：KCl，6.9；KH₂PO₄，0.9；NaHCO₃₃，25；氯化钠（NaCl），47.2；MgCl₂(H₂O₆，0.1；（NH₄)CO₃，0.5；HCl，15.6；CaCl₂（H₂O₂，0.075。此外，人工胃液中含有2 g/L的II型猪胃黏蛋白。
   2. 用1 M HCl调节pH至3（如需要）。在37 °C、100 rpm条件下孵育。收集2 mL样品（S2）。
3. 小肠消化：
   1. 加入 4 mL 模拟肠液（SIF），其成分（单位：mmol L-1）为：KCl，6.8；KH₂PO₄，0.8；NaHCO₃₃，85；NaCl，38.4；MgCl₂(H₂O₆，0.33；HCl，8.4；CaCl₂(H₂O₂，0.3，加入消化管中。
   2. 必要时用 1 M NaOH 调节 pH 至 7。在 37 °C、100 rpm 条件下孵育。收集 2 mL 样品（S3）。

6. 细菌定植能力检测 体外 胃肠道转运条件

1. 取2 mL小肠消化液，在2,650 × g 条件下离心10分钟。
2. 弃去上清液，将细菌沉淀与5 mL不含抗生素和抗真菌剂的补充DMEM培养基混合。
3. 使用流式细胞仪对完整/受损细胞进行染色和定量（参见材料表）。
4. 用不含抗生素和抗真菌剂的补充DMEM培养基稀释，调整细胞密度至10⁵ 个活细胞/mL。
5. 移除transwell系统的顶室培养基，加入1.5 mL细菌悬液。在常规细胞培养条件下（37 °C，95%湿度，5% CO₂）共培养2小时。
   注意：根据实验方案需求，此时间可延长至48小时。为避免污染，共培养过程可在与常规细胞维持不同的培养箱中进行。
6. 孵育后测定TEER值，以评估上皮屏障完整性，方法见4.11节。
7. 完成孵育后，移除顶室培养基，并收集0.5 mL用于后续分析（S4）。可取部分培养基样品，按照制造商说明，通过乳酸脱氢酶（LDH）检测法评估细胞活力（参见材料表）。
8. 在HT29-MTX细胞产生的黏液层上加入0.5 mL含10 mM N-乙酰半胱氨酸的HBSS缓冲液（NAC缓冲液），以溶解黏液并回收黏附的细菌。将培养板置于37 °C、振荡（135 rpm，参见材料表）条件下孵育1小时。
9. 将NAC-HBSS溶液转移至微量离心管中（S5），并用1 mL DPBS洗涤细胞两次。
10. 在单层细胞上加入0.5 mL 0.5%（w/v）Triton X-100溶液，通过移液吹打使细胞裂解，收集液体并涡旋震荡1分钟。震荡速度至关重要，以避免去垢剂损伤细菌细胞。
11. 将细胞样品在2,650 × g 条件下离心5分钟，分离上清液（S6）和沉淀（S7）。

7. 样本分析

注意：对收集的样品（S1-S7）进行分析，以评估细菌在模拟胃肠道消化后的存活能力及其对肠道细胞的黏附潜力。

1. 细菌活性：将样品 S1-S5 通过 0.45 µm 滤膜过滤两次，并按照步骤 2.8 所述，使用活/死细胞染色结合流式细胞术对细菌细胞进行定量。
2. 黏附潜能：对 S1-S6 样品进行连续稀释（-1 至 -8），取 10 µL 涂布于血琼脂平板和改良 BHI 平板。在 37 °C 厌氧条件下培养 24–48 小时。对未稀释的 S7 样品取相同体积进行涂布。
   1. 黏附细菌的分类学鉴定：
      1. 用接种环挑取单个菌落，分别重悬于 10 µL 无核酸酶水中。取 4 µL 该悬液作为模板，使用 2.7.1 中所述引物和条件对 16S rRNA 基因进行 PCR 扩增。
      2. 按照 2.7.3 中的方案进行测序，并采用 2.7.4 中所述程序对序列进行验证。
3. 根据需要进行后续分析，如总 DNA 提取、qPCR 定量和/或 16S rRNA 扩增子测序、RNA 提取及转录组分析。
   注意：流式细胞术定量在取样后立即进行。以经 70 °C 处理 3 分钟的样品作为细胞膜通透性对照。通过流式细胞术检测消化液或无菌条件下细胞培养模型获得的样品，评估背景噪声。每个样品均设三个重复。

 

表1：细胞系及其培养基组成用于细胞培养的维持。

细胞培养	贴壁/悬浮	培养基	常规补充剂	特定补充剂	倍增时间	孵育条件
Caco-2（ECACC 86010202）	贴壁的	含4.5 g/L葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	灭活胎牛血清（10% v/v） 青霉素（100 U/mL）* 链霉素（0.1 mg/mL）* 两性霉素（0.0025 mg/mL）*	谷氨酰胺（4 mM）非必需氨基酸（1% v/v）丙酮酸（1 mM）	65–72 小时	95% 湿度和 10% CO₂2 CO2 培养箱（参见 材料表)
HT29-MTX（ECACC 12040401）	贴壁的			HEPES（1 mM）	20–24 小时
* 在开始检测前2天，从细胞培养基中去除抗生素和抗真菌剂。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
菌株
Aggregatibacter actinomycetemcomitans	美国典型培养物保藏中心	ATCC 43718
Fusobacterium nucleatum	美国典型培养物保藏中心	ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis	美国典型培养物保藏中心	ATCC 33277
Prevotella intermedia	美国典型培养物保藏中心	ATCC 25611
Streptococcus mutans	美国典型培养物保藏中心	ATCC 25175
Streptococcus sobrinus	美国典型培养物保藏中心	ATCC 33478
Actinomyces viscosus	美国典型培养物保藏中心	ATCC 15987
Streptococcus salivarius TOVE-R
Streptococcus mitis	美国典型培养物保藏中心	ATCC 49456
Streptococcus sanguinis	BCCM/LMG 细菌保藏中心	LMG 14657
Veillonella parvula	莱布尼茨微生物与细胞培养物保藏中心（DSMZ）	DSM 2007
Streptococcus gordonii	美国典型培养物保藏中心	ATCC 49818
细胞系
Caco-2 细胞	欧洲认证细胞培养物保藏中心	86010202
HT29-MTX 细胞	欧洲认证细胞培养物保藏中心	12040401
试剂与耗材
脑心浸液（BHI）培养基	Oxoid	CM1135
血琼脂 2	Oxoid	CM0055	血琼脂培养基
甲萘醌	Sigma	M9429
血红素	Sigma	H9039
5% 无菌脱纤维马血	E&O Laboratories Ltd,	P030
InnuPREP PCRpure 试剂盒	Analytik Jena	845-KS-5010250	PCR 纯化试剂盒
Big Dye	Applied Biosystems	4337454	测序染料
ABI Prism BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒	Applied Biosystems	4337456
SYBR Green I	Invitrogen	S7585
碘化丙啶	Invitrogen	P1304MP
未包被、细胞培养处理、带通气盖、无菌的 T25 培养瓶	VWR	734-2311
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	T3924-100ML
0.4% 台盼蓝溶液，液体，无菌过滤	Sigma-Aldrich	T8154
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	14190250
含 GlutaMAX 和丙酮酸钠的 DMEM 细胞培养基	Life technologies	31966-047
Corning Transwell 聚酯膜细胞培养小室	Sigma-Aldrich	CLS3450-24EA
猪胃黏蛋白 II 型	Sigma-Aldrich	M2378
灭活胎牛血清	Greiner Bio One	758093
抗生素-抗真菌剂（100X）	Gibco	15240062
分子生物学用 Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
不含钙、镁的 DPBS	Gibco	14190-250
Pierce LDH 细胞毒性检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	88953
Corning HTS Transwell-24 孔，孔径 0.4 µm	Corning Costar Corp	3450
无核酸酶水	Serva Electrophoresis	28539010
仪器设备
改进型 Neubauer 计数板	Carl Roth	T729.1
BD Accuri C6 流式细胞仪	BD Biosciences	653118
PowerLyzer 24 匀浆器	MoBio	13155
T100 梯度 PCR 仪	BioRad	186-1096
灌流系统	定制	-
InnOva 4080 恒温摇床	New Brunswick Scientific	8261-30-1007	2.10 用摇床
Memmert CO₂ 培养箱	Memmert GmbH & Co.	ICO150med
Millicell ERS（电阻力系统）	EMD Millipore, Merck KGaA	MERS00002
Millipore Milli-Q academic 超纯水系统	Millipore, Merck KGaA	-
摇床（ROCKER 3D basic）	IKA	4000000	6.10 用摇床