基于荧光的口腔厌氧菌活力评估

摘要

来源：Calatayud Arroyo, M., et al. 在体外肠道宿主-微生物界面评估合成细菌群落的存活能力。J. Vis. Exp. (2018)

该视频演示了一种利用荧光染料和流式细胞术评估厌氧口腔细菌活力的方法。首先在无氧肉汤中培养细菌，然后从血琼脂平板上挑取单个菌落重新悬浮。经过培养和稀释后，使用可穿透和不可穿透细胞膜的染料对菌液进行染色。随后通过流式细胞术区分活细胞与死细胞：活细胞呈现绿色荧光，死细胞呈现红色荧光。

方案

1. 菌株与培养条件

注意： 合成的口腔菌群由口腔微生物组中常见的菌株组成。

1. 从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获取以下菌株：Aggregatibacter actinomycetemcomitans（ATCC 43718）、Fusobacterium nucleatum（ATCC 10953）、Porphyromonas gingivalis（ATCC 33277）、Prevotella intermedia（ATCC 25611）、Streptococcus mutans（ATCC 25175）、Streptococcus sobrinus（ATCC 33478）、Actinomyces naeslundii（ATCC 51655）、Streptococcus gordonii（ATCC 49818）、Actinomyces viscosus（ATCC 15987）以及 Streptococcus mitis（ATCC 49456）。
2. 从德国微生物与细胞培养物保藏中心莱布尼茨研究所（DSMZ）获取 Veillonella parvula（DSM 2007），从比利时微生物保藏中心/列日大学细菌保藏中心（BCCM/LMG）获取 Streptococcus sanguinis（LMG 14657），并使用 Streptococcus salivarius 菌株 TOVE-R9 和 Streptococcus oralis。

2. 口腔微生物组代表性多物种群落的构建

注意： 构建合成菌群以模拟口腔细菌的潜在黏附能力 体外 肠道上皮。在添加了5 μg/mL血红素、1 μg/mL甲萘醌和5%无菌去纤维马血的血琼脂平板上培养细菌。简而言之：

1. 将100 mg血红素溶解于2 mL 1 M NaOH中，加入100 mL蒸馏灭菌水。置于避光容器中保存。使用前经0.22 µm滤器除菌。
2. 将100 mg甲萘醌溶解于20 mL 96%乙醇中。添加至培养基前经0.22 µm滤器除菌。
3. 根据制造商说明配制1 L血琼脂培养基（见材料表），并进行高压灭菌。待冷却后加入马血和补充剂。混匀后倾注平板。
4. 配制改良脑心浸液（BHI）液体培养基。高压灭菌后加入5 μg/mL血红素和1 μg/mL甲萘醌。
5. 将9 mL培养基分装至Hungate管中，用橡胶塞和铝盖密封。通入N₂/CO₂（90%/10%）气体置换。
6. 用注射器取出1 mL厌氧培养基，转移至1.5 mL微量离心管中。挑取各细菌菌种的单菌落，重悬于培养基中，再转接回厌氧改良BHI培养基。除S. salivarius需培养24 h外，其余均在37 °C下培养48 h。
7. 培养结束后，采用流式细胞术结合SYBR Green/碘化丙啶染色测定细胞数量。用改良BHI培养基将菌液稀释至10⁵ cells mL^-1。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
菌株
Aggregatibacter actinomycetemcomitans	美国典型培养物保藏中心	ATCC 43718
Fusobacterium nucleatum	美国典型培养物保藏中心	ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis	美国典型培养物保藏中心	ATCC 33277
Prevotella intermedia	美国典型培养物保藏中心	ATCC 25611
Streptococcus mutans	美国典型培养物保藏中心	ATCC 25175
Streptococcus sobrinus	美国典型培养物保藏中心	ATCC 33478
Actinomyces viscosus	美国典型培养物保藏中心	ATCC 15987
Streptococcus salivarius TOVE-R
Streptococcus mitis	美国典型培养物保藏中心	ATCC 49456
Streptococcus sanguinis	BCCM/LMG 细菌保藏中心	LMG 14657
Veillonella parvula	莱布尼茨微生物与细胞培养物保藏中心（DSMZ）	DSM 2007
Streptococcus gordonii	美国典型培养物保藏中心	ATCC 49818
细胞系
Caco-2 细胞	欧洲认证细胞培养物保藏中心	86010202
HT29-MTX 细胞	欧洲认证细胞培养物保藏中心	12040401
试剂与耗材
脑心浸液（BHI）培养基	Oxoid	CM1135
血琼脂 2	Oxoid	CM0055	血琼脂培养基
甲萘醌	Sigma	M9429
血红素	Sigma	H9039
5% 无菌去纤维马血	E&O Laboratories Ltd,	P030
SYBR Green I	Invitrogen	S7585
碘化丙啶	Invitrogen	P1304MP
PBS	Gibco	14190250
仪器设备
BD Accuri C6 流式细胞仪	BD Biosciences	653118
Memmert CO₂ 培养箱	Memmert GmbH & Co.	ICO150med
Millipore Milli-Q 学术型超纯水系统	Millipore, Merck KGaA	-