从叶片中提取总DNA以检测细菌感染

摘要

来源：Chen, H., 等．利用常规PCR对柑橘叶片组织样本中柑橘黄龙病病原菌Candidatus liberibacter spp.进行特异且准确的检测．J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了从感染致病细菌的柑橘叶片组织中提取总基因组DNA的方法。该方案可实现可靠的DNA回收，用于后续基于PCR的韧皮部限制性病原体检测。

方案

1. 使用基因组提取试剂盒从植物组织中分离基因组DNA

1. 使用干净的剪刀从柑橘树上剪下一片完整的鲜叶，获取柑橘叶片组织，并将叶片放入干净的塑料三明治袋中。
   注意：采集后应尽快将装有叶片组织的袋子置于4 °C冰箱中或放在装有冰块的保温容器中，以避免组织变质。
2. 加入少量液氮预冷研钵和研杵。在冷却过程中，使用剪刀剪取一小片叶片组织，大小约为1平方英寸。将剪下的组织放入研钵中，使其迅速冻结。如有需要，可补充更多液氮。
   注意：操作液氮时应始终佩戴隔热手套。
3. 使用研钵快速将植物组织研磨成细粉。持续研磨直至液氮完全蒸发，留下细腻的绿色粉末。
4. 将金属刮勺在液氮中短暂冷却10 - 15秒，然后用刮勺将研磨后的组织从研钵中转移至1.5 mL微量离心管中。
5. 使用1000 µL移液器加入600 µL核裂解液（见材料表）。涡旋震荡样品1 - 3秒，然后在65 °C水浴中孵育15分钟。
6. 使用10 µL移液器向裂解物中加入3 µL RNase溶液，轻轻颠倒混匀2 - 5次，并在37 °C培养箱中孵育15分钟。
   注意：继续下一步前，请让混合物冷却至室温。
7. 加入200 µL蛋白质沉淀液，高速涡旋震荡20秒，然后在13,000 x g条件下离心3分钟，形成紧密沉淀。在样品离心的同时，向一个新的1.5 mL微量离心管中加入600 µL室温异丙醇。
8. 使用1000 µL移液器小心吸取离心后样品的上清液，转移至含有异丙醇的新1.5 mL微量离心管中。此时可弃去沉淀。
   注意：为避免蛋白质污染上清液，应在沉淀上方保留极微量的上清液。
9. 轻轻颠倒离心管，直至DNA以丝状团块形式可见，然后在室温下以13,000 x g离心1分钟。
10. 倾去上清液，向沉淀中加入600 µL 70%乙醇，反复颠倒数次以洗涤DNA，随后在13,000 x g条件下离心1分钟。
11. 小心吸除乙醇，保留松散的DNA沉淀，然后打开管盖并倒置放置于吸水纸上。在室温下空气干燥15分钟。
12. 向干燥的DNA沉淀中加入100 µL DNA重悬液，然后将DNA样品置于65 °C水浴中孵育1小时，期间通过轻弹管壁定期混匀。
13. 在微量比色皿中加入1 µL纯化水，并将其插入分光光度计作为空白对照。将1 µL样品加入另一微量比色皿中，插入分光光度计测定吸光度，计算DNA浓度。DNA浓度（ng/µL）可通过公式（A₂₆₀ - A₃₂₀）×稀释倍数×50 ng/µL计算得出。
    注意：此处可暂停实验流程。样品可在4 °C条件下保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒	Promega	A1120	细胞核裂解液、RNase、蛋白质沉淀液和 DNA 重悬液的来源
液氮	Air Products	N/A
5424 台式离心机	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 数字水浴锅	Fisher scientific	15-462-15Q
金属刮勺	Sigma-Aldrich	Z283274
研钵和研杵	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE 涡旋混合器	Corning	6775
2-丙醇	Sigma-Aldrich	I9516
无菌 10 μL 吸头	TipOne	1161-3730
无菌 200 μL 吸头	TipOne	1163-1730
无菌 1250 μL 吸头	TipOne	1161-1750
可调体积移液器套装	VWR	75788-460
Tris 碱	Sigma-Aldrich	10708976001
1.5 mL 微量离心管	Thermo Fisher Scientific	3439