评估基因拷贝数在细菌抗生素耐药性进化中的作用

摘要

来源：Escudero, J. A., 等. 多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中的作用检测。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了通过逐步增加头孢唑林暴露浓度，比较三种含有不同拷贝数氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌（E. coli）菌株的存活情况。结果显示，仅含有多拷贝质粒的菌株能在较高药物浓度下存活，凸显了基因拷贝数增加可加速抗性进化的现象。

方案

1. 实验进化抗生素耐药性的进化救援方法

1. 在LB平板上划线接种待研究的菌株：MG1655::resA 以及MG1655/pRESA和敏感亲本菌株MG1655。
   注意： 质粒pRESA在MG1655中应具有稳定性，因此无需在LB平板中添加抗生素。突变率在 E. coli 足够低，因此一旦验证构建正确后，无需在每一步都验证质粒序列。
2. 在每个孔中加入 200 µL LB 培养基，准备 96 孔板，并将每种菌株的 48 个单菌落分别接种至独立的孔中（每种菌株使用一块板）。在 37 °C、200 rpm 条件下过夜培养。保存这些创始菌群的冷冻菌种。
   注意： 为防止和控制96孔板中的培养物交叉污染，采用棋盘式板设计，在整个96孔板中将接种孔与不含细菌的培养基孔交替排列。在整个实验进化过程中均使用此板设计。
3. 通过将含有奠基者种群的培养板中每个孔的2 µL菌液接种到新的96孔板中，启动进化拯救实验，新板每孔含有198 µL添加了亚抑制浓度抗生素的LB培养基。在进化拯救实验中，针对三种菌株，初始抗生素浓度采用其最低抑菌浓度（MIC，先前已测定）的1/4或1/8，并在LB培养基中每日将抗生素浓度倍增。采用此方法以最大化种群获得耐药突变的概率。将培养板置于37 °C、200 rpm条件下振荡培养20小时。
   注意： 测定起始菌群的过夜培养OD值。如果不同菌株间的OD值存在显著差异，则需调整初始接种量，使每个孔中的起始细胞数量一致。
4. 每天测量各菌群经前夜培养后的 OD 值，并按照 1.3 节所述方法，将培养物转接到新的 96 孔板中，新孔板中抗生素浓度为前一天的两倍。将 96 孔板在 37 °C、200 rpm 条件下培养 20 小时。
   注意： 1:100的稀释倍数每天可产生约6-7代。
5. 同时，在不添加抗生素的条件下，按照1.3和1.4中所述的相同条件，平行扩增每种菌株的对照群体。
   注意： 对照种群有助于区分由抗生素存在引起的突变和帮助细菌适应实验条件的普通突变。在无抗生素情况下出现的平行突变可能有助于细菌适应实验条件，而与抗生素耐药性无关。
6. 每天使用酶标仪通过测量培养物在600 nm波长处的吸光度（OD）来追踪存活种群的数量。
   注意： 光密度值低于 0.1 表明种群已灭绝。参见 图1 以生存曲线为例。
7. 定期（每3-5天）保存所有群体的冷冻储备。
8. 使用log-rank检验[包 "存活率" 使用 RStudio（版本 0.99.486）分析不同菌株群体在抗生素浓度递增条件下随时间变化的存活率差异。
   注意： 该实验将确定多拷贝质粒是否会促进所研究的特定抗生素及其对应基因的抗生素耐药性进化。

结果

图1. 随着抗生素浓度增加的生存曲线。 表示属于菌株MG1655、MG1655::resA和MG1655/pRESA的可存活群体数量随时间的变化。每种菌株的48个群体在头孢他啶和美罗培南抗生素浓度递增的条件下传代培养，从第1天开始使用MIC的1/8浓度，并每天将抗生素浓度加倍。红色虚线垂直线表示所研究抗生素的MIC。注意，在头孢他啶的情况下，不同菌株群体的存活率随时间存在显著差异（log-rank检验，P< 0...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养箱	Memmert	UF1060
摇床培养箱	Cole-Parmer Ltd	SI500
移液器	Biohit	725020, 725050, 725060, 725070
多通道移液器	Biohit	728220, 728230,728240
酶标仪 Synergy HTX	BioTek	BTS1LF
接种环	Sigma-Aldrich	I8388
96孔板	Falcon	351172
LB 培养基	BD Difco	DF0446-17-3
LB 琼脂	Fisher scientific	BP1425-500
抗生素	Sigma-Aldrich
培养皿	Sigma-Aldrich	D9054
冻存管	ClearLine	390701
96孔板	Thermo Fisher Scientific	249945