表达抗凋亡细菌蛋白的宿主细胞中凋亡抑制作用的免疫印迹分析

摘要

来源： Berens, C. 等 应用可诱导表达系统研究细菌毒力因子对细胞内信号通路的干扰 视频实验杂志 (2015)

本视频展示了利用免疫印迹技术检测细菌效应蛋白 CaeB 在人细胞中对细胞凋亡的抑制作用。视频概述了在表达效应蛋白的宿主细胞中，通过多西环素诱导促凋亡蛋白表达后，检测凋亡标志物的各个步骤。

方案

1. 通过免疫印迹分析分析宿主细胞凋亡

1. 在收获细胞前，于光学显微镜下检查细胞，以确认是否出现细胞死亡。凋亡细胞可通过其周围存在的凋亡小体进行识别。
2. 移除上清液，并用预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁细胞一次。将细胞重悬于100 µl的2x Laemmli上样缓冲液中，在95 °C加热5分钟，随后于-20 °C保存。
3. 每份样品上样约4 × 10⁴个细胞至12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶中。同时，上样6 µl商用蛋白ladder作为分子量标记。在凝胶电泳系统中，使用1x Laemmli电泳缓冲液，于恒定电压180 V下电泳45–60分钟。
4. 使用Trans-Blot SD半干转印系统，在16 V恒定电压下，将蛋白转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（孔径0.45 µm）上，转印时间为60分钟。
5. 将膜置于含5%脱脂奶粉的PBS/0.05% Tween 20（MPT）溶液10 ml中，室温（RT）封闭1小时。
6. 将4 µl抗切割型多聚ADP-核糖聚合酶（PARP）一抗溶于4 ml MPT中，4 °C孵育过夜（O/N）。
7. 用10 ml PBS/0.05% Tween 20溶液进行三次洗涤，每次10分钟。
8. 将膜与0.8 µl辣根过氧化物酶标记的二抗溶于4 ml MPT中孵育。
9. 室温孵育1小时后，用PBS/0.05% Tween 20溶液洗涤膜三次，按照生产商说明书使用商用检测试剂盒检测辣根过氧化物酶活性。使用标准显影设备显影以观察蛋白条带。
10. 用7 ml Western Blot stripping缓冲液在室温孵育30分钟，去除已结合的抗体。
11. 用PBS/0.05% Tween 20溶液洗涤三次后，将膜与4 µl抗肌动蛋白（actin）一抗溶于4 ml MPT中，4 °C孵育过夜（O/N）。
12. 用MPT溶液洗涤三次后，将膜与0.8 µl辣根过氧化物酶标记的二抗溶于4 ml MPT中孵育。
13. 室温孵育1小时后，用PBS/0.05% Tween 20溶液洗涤膜三次，按照生产商说明书使用商用检测试剂盒检测辣根过氧化物酶活性。使用标准显影设备显影以观察蛋白条带。
    注意：所有孵育步骤均在摇床上按指定时间和温度进行。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多西环素	Sigma Aldrich	D9891
Trans-Blot SD 半干式转膜仪	Bio-Rad	170-3940
PageRuler 预染蛋白 Marker	Thermo Scientific	26616
PVDF 膜	Millipore	IPVH00010
抗 GFP 抗体	Life Technologies	A6455
抗切割型 PARP 抗体	BD Bioscience	611038
鼠 IgG (H+L)-HRP	Dianova	111-035-062
ECL 化学发光 Western 印迹底物	Thermo Scientific	32106