建立共培养模型在气液界面研究宿主-病原体相互作用

摘要

来源：Montefusco-Pereira, C. V. 等. 铜绿假单胞菌 感染的支气管上皮细胞与巨噬细胞三维共培养气液界面模型用于抗感染药物的临床前评价。视频实验杂志(2020)

本视频展示了一种在气液界面处支气管上皮细胞与类似巨噬细胞共培养的模型，用于研究宿主与病原体之间的相互作用。致病性细菌感染会破坏上皮细胞膜的完整性，从而触发类似巨噬细胞的活化，并促进病原体的清除。

方案

1. 可渗透支持膜插件中细胞的生长与分化

1. 在37 °C、5% CO₂ 条件下，使用含10%胎牛血清（FCS）、1%非必需氨基酸和600 mg/L葡萄糖的13 mL最低必需培养基（MEM），在T75培养瓶中培养CFBE41o-细胞。每2–3天向细胞中添加新鲜培养基。
   1. 当培养瓶中细胞融合度达到70%时，加入3 mL胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）于37°C作用15分钟使细胞脱落。加入7 mL新鲜MEM，室温下以300 x g离心4分钟。弃去上清液，加入10 mL MEM，并通过轻柔吹打分散细胞团块。
   2. 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数。以每孔2 × 10⁵ 个细胞的密度，将细胞接种至带有通透性支持膜的12孔板中（孔径3 μm，参见材料表）。
      注意：自动细胞计数仪可测定细胞数量、大小分布及细胞活力（参见材料表）。此处也可使用孔径为0.4 μm的通透性支持膜；但在该条件下，巨噬细胞应直接加至顶端侧，且无法评估其跨细胞迁移。
   3. 通过在通透性支持膜的顶端侧加入500 µL细胞悬液、基底侧加入1.5 mL新鲜培养基，建立液-液界面培养条件（LLC）。随后于37°C、5% CO₂条件下培养72小时。
   4. 接种后第三天，转为气-液界面（ALI）培养：先从基底侧移除培养基，再从顶端....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase	Accutase	AT104
氨苄青霉素	Carl Roth，德国	HP62.1
CASY TT 细胞计数器与分析仪	OLS Omni生命科学	-
CellTrace Far Red	赛默飞世尔科技	C34564
Centrifuge Universal 320R	德国赫滕	1406
CFBE41o- 细胞	1. 格吕尼特细胞系保藏与分发项目 2. 西格玛奥德里奇	1. Dieter C. Gruenert博士惠赠 2. SCC151
用于EVOM2的筷子式电极组，4 mm	World Precision Instruments，萨拉索塔，美国	STX2
D-(+)葡萄糖	默克	47829
上皮伏特计	美国萨拉索塔，世界精密仪器公司	EVOM2
12孔板用Falcon可渗透支持物，带3.0μm透明PET膜，无菌	康宁，阿姆斯特丹，荷兰	353181
胎牛血清	Lonza，巴塞尔，瑞士	DE14-801F
LB肉汤	Sigma-Aldrich，德国	L2897-1KG
MEM（最低必需培养基）	Gibco 赛默飞世尔科技公司	11095072
非必需氨基酸溶液（100X）	Gibco 赛默飞世尔科技公司	11140050
P. aeruginosa 菌株PAO1	美国典型培养物保藏中心	47085
P. aeruginosa 菌株 PAO1-GFP	美国模式培养物集存库	10145GFP
磷酸盐缓冲液缓冲液	赛默飞世尔科技	10010023
培养皿	Greiner	664102
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）	德国 Sigma	P8139-1MG
Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基	Lifetechnologies 公司旗下 Gibco 品牌，Paisley，英国	11875093
T75 培养瓶	Thermo Fischer	156499
THP-1 细胞	德国微生物和细胞培养物保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ；德国布伦瑞克）	No. ACC-16
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	赛默飞世尔科技	25300054