建立共培养模型在气液界面研究宿主-病原体相互作用

摘要

来源：Montefusco-Pereira, C. V. 等. 铜绿假单胞菌 感染的支气管上皮细胞与巨噬细胞三维共培养气液界面模型用于抗感染药物的临床前评价。视频实验杂志(2020)

本视频展示了一种在气液界面处支气管上皮细胞与类似巨噬细胞共培养的模型，用于研究宿主与病原体之间的相互作用。致病性细菌感染会破坏上皮细胞膜的完整性，从而触发类似巨噬细胞的活化，并促进病原体的清除。

方案

1. 可渗透支持膜插件中细胞的生长与分化

1. 在37 °C、5% CO₂ 条件下，使用含10%胎牛血清（FCS）、1%非必需氨基酸和600 mg/L葡萄糖的13 mL最低必需培养基（MEM），在T75培养瓶中培养CFBE41o-细胞。每2–3天向细胞中添加新鲜培养基。
   1. 当培养瓶中细胞融合度达到70%时，加入3 mL胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）于37°C作用15分钟使细胞脱落。加入7 mL新鲜MEM，室温下以300 x g离心4分钟。弃去上清液，加入10 mL MEM，并通过轻柔吹打分散细胞团块。
   2. 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数。以每孔2 × 10⁵ 个细胞的密度，将细胞接种至带有通透性支持膜的12孔板中（孔径3 μm，参见材料表）。
      注意：自动细胞计数仪可测定细胞数量、大小分布及细胞活力（参见材料表）。此处也可使用孔径为0.4 μm的通透性支持膜；但在该条件下，巨噬细胞应直接加至顶端侧，且无法评估其跨细胞迁移。
   3. 通过在通透性支持膜的顶端侧加入500 µL细胞悬液、基底侧加入1.5 mL新鲜培养基，建立液-液界面培养条件（LLC）。随后于37°C、5% CO₂条件下培养72小时。
   4. 接种后第三天，转为气-液界面（ALI）培养：先从基底侧移除培养基，再从顶端侧移除。向基底侧加入500 µL新鲜MEM，每隔一天更换一次培养基，直至细胞形成融合的单层。
      注意：本实验方案所用条件下，CFBE41o-细胞通常在培养3–7天后达到融合状态。
   5. 在第7天评估上皮屏障特性：于37°C、5% CO₂条件下，在顶端侧加入500 μL细胞培养基，基底侧加入1.5 mL培养基，孵育1小时。
   6. 使用STX2筷子式电极和上皮细胞伏特-欧姆计，通过跨上皮电阻（TEER）测定屏障特性；培养7天后TEER值应高于300 Ω×cm²。
      注意：部分膜插件中的细胞TEER值可能较低。因此，TEER < 300 Ω×cm²的通透性插件不予使用。
2. THP-1细胞培养方法：在T75培养瓶中加入13 mL含10% FCS的RPMI 1640培养基（Roswell Park Memorial Institute），于37°C、5% CO₂条件下培养。每隔一天将细胞以2 × 10⁶ 个细胞/mL的密度传代至新的T75培养瓶。
   注意：未分化的THP-1细胞以悬浮单核细胞形式生长。
   1. THP-1细胞分化操作如下：将T75培养瓶中的细胞以300 x g离心4分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于新鲜培养基后转移至新T75培养瓶。加入10 ng/mL佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸盐（PMA），在RPMI培养基中于37°C、5% CO₂条件下孵育48小时。
      注意：经PMA诱导分化后，细胞不再增殖并贴附于培养瓶壁。
   2. 为使THP-1来源的巨噬细胞样细胞脱落，先用37°C磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，再加入含0.5 mM EDTA的3 mL细胞解离液（如accutase），室温孵育10分钟。
   3. 在倒置显微镜下观察细胞脱落情况。加入7 mL新鲜培养基，室温下以300 x g离心4分钟。
      注意：也可使用胰蛋白酶-EDTA（37°C作用20分钟）使巨噬细胞脱落，但相比所选细胞解离液（参见材料表），胰蛋白酶对巨噬细胞损伤更大。
   4. 弃去上清液后，将巨噬细胞重悬于15 mL离心管中的3 mL THP-1培养基中，按步骤1.1.2所述方法计数，并在建立共培养体系前于37°C、5% CO₂条件下最多孵育1小时。
      注意：悬浮状态的THP-1细胞可用活细胞染料染色，以便后续共培养成像。此步骤请参考下文操作（步骤1.2.5）。
   5. 用10 µM细胞活度染料（基于细胞内酯酶对乙酰基团的转化作用，参见材料表）对巨噬细胞染色，向细胞悬液中加入3 µL染料。于37°C、5% CO₂条件下孵育20分钟后，用37°C PBS洗涤一次以去除未结合染料。
      注意：室温下以300 x g离心4分钟去除染料。

2. 在可渗透支持物上建立上皮细胞-巨噬细胞共培养体系

1. 使用在气液界面（ALI）培养且TEER值≥300 Ω×cm²的CFBE41o-单层细胞（步骤1.1.6）。移除下室中的培养基，将Transwell小室小心倒置放入无菌玻璃培养皿（50 mm × 200 mm）中，然后使用细胞刮刀去除穿过膜孔并在膜底侧过度生长的细胞。
   注意：由于膜孔径为3 µm，上皮细胞容易穿过孔隙向基底侧生长，因此在基底侧接种巨噬细胞前必须将其清除。此步骤中可对CFBE41o-肺上皮细胞进行染色。可采用步骤1.2.5中的方法，但无需加入细胞悬液，而是仅在可渗透支持膜上的贴壁细胞顶端侧加入MEM配制的染料溶液（500 µL）。
2. 取PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞悬液，每孔加入2 × 10⁵个细胞（溶于200 µL RPMI培养基中），接种至倒置小室的基底侧。
3. 小心盖上培养皿，于37 °C、5% CO₂条件下孵育2小时。
4. 将小室重新放回12孔板中，并在可渗透支持膜的基底侧加入500 µL MEM培养基，以维持气液界面条件。此时细胞已准备好用于感染实验。

3. 感染通过 铜绿假单胞菌

注意：此后所有步骤均须在生物安全二级（BSL2）实验室中进行。

1. 取一个P. aeruginosa PAO1-GFP 单菌落，接种于含有 300 μg/mL 氨苄青霉素的 15 mL 赖氨酸肉汤（LB）培养基中，置于 50 mL 锥形瓶内。
   注意：也可使用其他 P. aeruginosa 菌株，例如 PAO1 野生型、PA14 或临床分离株，具体操作需遵循各自相应的培养方案。
2. 将细菌在 37°C、180 rpm 振荡条件下培养 18 小时。
3. 将培养 18 小时后的菌液转移至 50 mL 圆锥管中，在 3850 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，加入 10 mL 37°C 的无菌 PBS 缓冲液。
4. 使用分光光度计在 600 nm 波长下测定光密度，并用细胞培养基调整细菌浓度至终浓度为 2 × 10⁵ 菌落形成单位（CFU）/mL。此浓度相当于每个上皮细胞感染一个细菌的感染复数（MOI）。
5. 在可渗透支持膜的顶端（步骤 2.4）加入 100 μL 细菌悬液，于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 1 小时，使细菌附着于细胞表面。随后用移液器小心移除顶端液体，恢复气液界面（ALI）状态。设部分样本不进行感染，作为对照。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase	Accutase	AT104
氨苄青霉素	Carl Roth，德国	HP62.1
CASY TT 细胞计数器与分析仪	OLS Omni生命科学	-
CellTrace Far Red	赛默飞世尔科技	C34564
Centrifuge Universal 320R	德国赫滕	1406
CFBE41o- 细胞	1. 格吕尼特细胞系保藏与分发项目 2. 西格玛奥德里奇	1. Dieter C. Gruenert博士惠赠 2. SCC151
用于EVOM2的筷子式电极组，4 mm	World Precision Instruments，萨拉索塔，美国	STX2
D-(+)葡萄糖	默克	47829
上皮伏特计	美国萨拉索塔，世界精密仪器公司	EVOM2
12孔板用Falcon可渗透支持物，带3.0μm透明PET膜，无菌	康宁，阿姆斯特丹，荷兰	353181
胎牛血清	Lonza，巴塞尔，瑞士	DE14-801F
LB肉汤	Sigma-Aldrich，德国	L2897-1KG
MEM（最低必需培养基）	Gibco 赛默飞世尔科技公司	11095072
非必需氨基酸溶液（100X）	Gibco 赛默飞世尔科技公司	11140050
P. aeruginosa 菌株PAO1	美国典型培养物保藏中心	47085
P. aeruginosa 菌株 PAO1-GFP	美国模式培养物集存库	10145GFP
磷酸盐缓冲液缓冲液	赛默飞世尔科技	10010023
培养皿	Greiner	664102
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）	德国 Sigma	P8139-1MG
Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基	Lifetechnologies 公司旗下 Gibco 品牌，Paisley，英国	11875093
T75 培养瓶	Thermo Fischer	156499
THP-1 细胞	德国微生物和细胞培养物保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ；德国布伦瑞克）	No. ACC-16
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	赛默飞世尔科技	25300054