在囊性纤维化患者痰液样本中可视化Pseudomonas aeruginosa

摘要

来源：Jackson, L.，等．囊性纤维化患者痰液中Pseudomonas aeruginosa的可视化观察．J. Vis. Exp．（2020）

本视频展示了利用荧光标记和共聚焦显微镜技术，对经化学透明化处理的囊性纤维化痰液样本中 Pseudomonas aeruginosa 进行原位可视化，以揭示细菌的定位分布及生物膜结构。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 水凝胶荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）实验方案
   1. 使用无菌镊子将水凝胶样品从保存溶液中取出，并置于无菌表面（如玻片或培养皿）上。
   2. 使用无菌手术刀将水凝胶切成约 1 mm 厚的薄片。
   3. 将1毫米的水凝胶片段放入无菌的1.5 mL离心管中。
   4. 在1.5 mL离心管中配制1 mL杂交缓冲液（25%甲酰胺，0.9 M NaCl，20 mM Tris-HCl [pH 7.6]，0.01%十二烷基硫酸钠（SDS），去离子纯化H2O）。
   5. 将荧光标记的 PseaerA 探针（150.7 nM）加入杂交缓冲液中，颠倒混匀。
      注意： 福尔马林溶液应远离明火。杂交缓冲液可预先配制，并分装后于 -20 °C 保存。
   6. 向每个约 1 mm 的水凝胶片段中加入 200–500 µL 杂交缓冲液，并确保水凝胶样品完全浸没。
   7. 将 PseaerA 探针与水凝胶样品在 46 °C 下避光孵育约 18–24 小时，期间不进行振荡。
   8. 将杂交缓冲液倒入废液收集容器中。
   9. 用滤膜除菌的洗涤缓冲液（337.5 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，5 mM EDTA（乙二胺四乙酸）[pH 7.2]，0.01% SDS，以及纯化去离子水）冲洗样品一次。₂O）向每个1.5 mL离心管中加入1 mL洗涤缓冲液，随后弃去。
      注意： 洗涤缓冲液可预先配制，并在室温（RT）下保存。
   10. 向各管中加入1 mL新鲜洗涤缓冲液，然后将样品在48 °C避光孵育6小时，不振荡。
2. 水凝胶与Psl0096抗体结合
   1. 使用1 mL移液器无菌移除洗涤缓冲液。
   2. 用1 mL含2%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液冲洗样品，随后移除溶液。
   3. 向水凝胶样品中加入500 µL的2% BSA/PBS溶液，以阻断非特异性蛋白结合。随后将样品在室温（RT）避光条件下静置孵育过夜，不进行振荡。
   4. 使用1 mL移液器无菌移除封闭液。
   5. 在500 µL新鲜的2% BSA/PBS中，将Psl0096-Texas Red抗体稀释至终浓度为0.112 µg/mL，配制抗体溶液。
   6. 将500 µL抗体溶液加入水凝胶样品中，在室温下避光孵育6 h，不进行振荡。
3. DAPI（4′,6′-二脒基-2-苯基吲哚）染色
   1. 将40 g非离子密度梯度介质、30 µL Tween20、3 µg叠氮化钠和30 mL PBS加入含有磁力搅拌子的烧瓶中，配制折射率匹配溶液（RIMS）。将溶液置于磁力搅拌器上搅拌15分钟，或直至完全溶解。
   2. 使用10 mL注射器和无菌0.2 µm滤器将溶液过滤除菌至50 mL离心管中。
      注意： 该溶液可在 4 °C 下保存数月。
   3. 用无菌的1 mL移液器移除Psl0096-Texas Red抗体溶液。
   4. 用1 mL PBS冲洗水凝胶样品，然后移除PBS。
   5. 将水凝胶样品与250 µL RIMS溶液及10 µg/mL DAPI在室温下避光、轻柔振荡孵育过夜。
   6. 在共聚焦成像前，将样品置于0.9 mm或1.7 mm的灌流腔室中，并用玻璃盖玻片密封。
      注意： 如果需要观察痰液中的黏液，在完成FISH和/或免疫组织化学染色后、浸入RIMS之前，可应用荧光标记的凝集素染色。
4. 成像
   1. 使用标准技术在25倍、40倍、63倍或100倍放大倍数下进行共聚焦激光扫描显微镜成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Coverwell 灌注腔室	Electron Microscopy Sciences	70326 -12/-14
PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC	Eurofins		订购详情：产品：修饰DNA寡核苷酸；名称：PseaerA；序列：[Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC；合成量：50 nmol；纯化方式：HPLC；运输状态：全产量（干粉）
Psl0096-Texas Red	Medimmune		Psl0096-Texas Red 抗体由 Medimmune 慷慨提供，订购咨询需联系该公司。