通过噬菌体介导的可切除抗生素盒转移在 E. coli 中实现基因缺失

摘要

来源：Saragliadis, A., 等．利用可切除抗生素抗性盒通过P1转导在Escherichia coli中构建基因缺失．J. Vis. Exp. （2018）

本视频展示了通过噬菌体介导的方式，将携带可切除抗生素抗性盒的供体DNA转入大肠杆菌（Escherichia coli）的过程。该整合型抗性盒通过同源重组替换目标基因，从而实现稳定的基因敲除。

方案

1. 噬菌体P1转导
   1. 受体菌的制备
      1. 在LB（溶菌肉汤）培养基中培养受体菌株BL21ΔABCF，使其在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）达到约1.0。使用分光光度计测量OD₆₀₀值。

      2. 计算实现感染复数（MOI）为0.5所需的噬菌体裂解液体积。为计算MOI，需根据培养物的OD₆₀₀估算细菌数量。假设OD₆₀₀值为1.0时对应约10⁹ cfu/mL。根据已知的裂解液滴度计算所需体积。

         示例：                   

         

      3. 向受体菌培养物中加入CaCl₂至终浓度为10 mM，并混匀。取1 mL该培养物用于转导。
2. 进行转导
   1. 按照步骤1.1.2计算的体积，将适量噬菌体裂解液加入含10 mM CaCl₂的1 mL受体菌培养物中，轻轻混匀。
      注意：吸取裂解液时应从上清液顶部取样，避免将氯仿带入混合物中。
   2. 将混合物在37 °C静置孵育20分钟。
   3. 加入pH 5.5的柠檬酸钠至终浓度100 mM，以终止感染。
   4. 离心收集细菌（5,000 × g，2分钟），弃去上清液，然后将菌体重悬于1 mL新鲜LB培养基中，该培养基含100 mM柠檬酸钠（pH 5.5）。
   5. 再洗涤细胞两次，以确保彻底去除游离噬菌体和钙离子。
   6. 将细菌重悬于1 mL含100 mM柠檬酸钠（pH 5.5）的新鲜LB培养基中，在30 °C振荡培养1小时（> 100 rpm）。
   7. 通过离心收集细菌（5,000 × g，2分钟），然后将其重悬于约100 μL含100 mM柠檬酸钠（pH 5.5）的LB培养基中。
   8. 将菌液涂布于添加了25 µg/mL卡那霉素和10 mM柠檬酸钠（pH 5.5）的LB平板上，在30 °C培养至菌落出现（约24小时）。
3. 筛选转导子
   1. 当选择性平板上长出菌落后，将其在LB + 卡那霉素平板上划线以获得单菌落，并在30 °C培养至单菌落出现。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Escherichia coli BL21DABCF	Addgene	102270	源自 BL21(DE3)
P1 病毒	NIG	HR16	通用型转导噬菌体
pCP20	CGSC	14177	带有 FLP 的条件性复制质粒
乙酸	ThermoFisher	33209
琼脂	BD Bacto	214010
琼脂糖	Lonza	50004
无水四环素	Abcam	ab145350
氯化钙	Merck	102382
卡那霉素	Applichem	A1493
氯化钠	VWR	27808
摇床培养箱	Infors HT	Minitron
培养箱	VWR	390-0482
微量离心机	Eppendorf	5415D
台式离心机	Beckman Coulter	B06322
涡旋混合器	Scientific Industries	SI-0236