分析香烟烟雾对肺上皮细胞抗菌防御功能的影响

摘要

来源：Li, T., et al. 研究香烟烟雾对肺上皮细胞中 Pseudomonas 感染的影响。 J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了香烟烟雾提取物如何通过减少抗菌肽（AMP）的产生，削弱肺上皮细胞的抗菌防御能力，从而导致细菌侵袭增加。该实验通过检测细胞内细菌载量，评估烟雾暴露对宿主-病原体相互作用的影响。

方案

1. 人肺上皮细胞培养及香烟烟雾提取物（CSE）处理

1. 在HITES培养基中培养人BEAS-2B细胞（500 mL DMEM/F12，2.5 mg胰岛素，2.5 mg转铁蛋白，2.5 mg亚硒酸钠，2.5 mg转铁蛋白，10 μM氢化可的松，10 μM β-雌二醇，10 mM HEPES，以及2 mM L-谷氨酰胺），并添加10%胎牛血清（FBS），具体方法如前所述24。
2. 在气道上皮细胞培养基（500 mL 气道细胞基础培养基，500 µg/mL HSA，0.6 µM 亚油酸，0.6 µg/mL 卵磷脂，6 mM L-谷氨酰胺，0.4% P 提取物，1.0 µM 肾上腺素，5 µg/mL 转铁蛋白，10 nM T3，1 µg/mL 氢化可的松，rh EGF 5 ng/mL，以及 5 µg/mL rh 胰岛素）中培养人原代小气道上皮细胞（HSAEC）。将细胞置于 37 °C、5% CO₂条件下孵育₂.
3. 用1 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞5分钟，直至细胞完全从培养板底部脱落。
4. 加入10 mL完全HITES培养基以中和胰蛋白酶，并将细胞收集至15 mL离心管中。在4 °C、300 x g条件下离心 g 5 分钟。
   警告： 通过显微镜仔细监测胰蛋白酶消化时间，因为过度消化可能导致细胞死亡。
5. 弃去上清液，将细胞重悬于2 mL含10% FBS的HITES培养基中。
6. 将上述细胞悬液10 µL用移液器加入培养板中，然后插入自动细胞计数仪，以获得细胞浓度（单位：cells/mL）。
7. 将BEAS-2B细胞以3 × 10⁵个细胞/mL的浓度接种于6孔板中，每孔总体积为2 mL，培养基为含10%胎牛血清的HITES培养基，过夜培养。
8. 在细胞汇合度约为80%或细胞密度为5 × 10⁵ 个细胞/mL时，用4%香烟烟雾提取物（CSE）处理细胞3小时。CSE处理前，更换为含1% FBS的HITES培养基。

2. 细菌感染

1. 向CSE处理的细胞各孔中加入P. aeruginosa或P. fluorescens Migula（约1 × 10⁷ CFU/mL），在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。
2. 吸除上清液，每孔加入2 mL新鲜HITES培养基，同时加入4% CSE和100 µg/mL庆大霉素。
   注意：使用庆大霉素是因为其无法穿透人肺上皮细胞膜，因此可杀死培养基中的所有细菌，但不能杀死已侵入肺上皮细胞内的细菌。
3. 在37 °C、5% CO₂条件下经CSE/庆大霉素处理1小时后，吸除上清液，用PBS洗涤细胞3次，用于后续细菌浓度测定。
   注意：为确认细菌已进入细胞内，使用荧光显微镜观察感染GFP标记的P. fluorescens Migula的细胞。

3. 采用涂布平板法测定细菌浓度

1. 采用滴板法测定感染细胞中的细菌载量时，用 2 mL 冷 PBS 将经庆大霉素处理的细胞洗涤 2 次。
2. 向每个孔中加入 1 mL 细胞裂解缓冲液（含 0.5% Triton X-100 的 PBS）。
3. 将含有内化细菌的细胞裂解物进行梯度稀释（1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000），用于后续接种至 TSB 琼脂平板。
4. 经 16 小时培养后，通过计数细菌菌落获得 CFU 结果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 mL 注射器	BD Biosciences
气道上皮细胞基础培养基	ATCC	PCS-300-030
细菌摇床	ThermoFisher Scientific
支气管上皮细胞生长试剂盒	ATCC	PCS-300-040
细胞计数仪	Bio-Rad
CFX96 实时荧光定量 PCR 系统	Bio-Rad
高容量 RNA 转 DNA 试剂盒	ThermoFisher Scientific	4387406
HITES 培养基	ATCC	ATCC 30-2004
人 BEAS-2B 细胞	ATCC	ATCC CRL-9609
人原代小气道上皮细胞	ATCC	ATCC PCS-300-030
OD 读数仪	USA Scientific
Pseudomonas aeruginosa	ATCC	ATCC 47085	PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens Migula	ATCC	ATCC 27853	P.aeruginosa GFP
科研级香烟 (3R4F)	肯塔基大学	TP-7-VA
胰蛋白胨大豆肉汤	BD Biosciences