用于研究细菌黏附人内皮细胞的微型平行板流动腔模型

摘要

来源：Claes, J., 等，流动条件下研究细菌黏附血管壁的体外与体内模型。J. Vis. Exp. （2015）。

本视频演示了一种利用接种了人原代内皮细胞的微型平行板流动腔研究宿主-病原体相互作用的方法。通过离子载体激活内皮细胞，并灌注荧光标记的细菌后，细胞释放血管性血友病因子（VWF），该因子在剪切流动条件下结合细菌黏附素。随后使用荧光显微镜观察并定量细胞表面黏附的细菌。

方案

1. 体外灌注实验

1. 玻璃盖玻片的包被
   1. 将血管性血友病因子（VWF）（Haemate P，储存浓度 2,400 µg/ml）用实验室级水（去离子蒸馏水）稀释至终浓度为 50 µg/ml。
   2. 将胶原蛋白用等渗葡萄糖溶液（SKF 溶液，pH 2.7–2.9，按生产商提供）稀释至终浓度为 160 µg/ml。
   3. 将200 µl包被液滴加到Parafilm上，然后将玻璃盖玻片（24 × 50 mm）置于液滴上方，使液滴在盖玻片表面均匀铺展，从而实现VWF或胶原的包被。
   4. 在室温（RT）下，将盖玻片置于湿润容器中孵育4小时。用钝头针小心地从石蜡膜上取下盖玻片。将盖玻片安装至流动池的底部。
2. 塑料载片的内皮细胞包被
   1. 用1 ml含1%明胶的磷酸盐缓冲液（PBS）包被塑料载片（1孔PCA细胞培养腔，Sarstedt，德国），在37°C孵育30分钟。将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）接种于明胶包被的塑料载片上，培养至70–80%融合度。将塑料载片安装至流动腔的底部组件中。
3. 灌流实验
   注意： 实验流程示意图 体外 灌注模型被表示为 图1.
   1. 执行 体外 在层流剪切应力为 2.5 dyne/cm 的微平行板流动腔中进行的细菌黏附研究² 和 20 达因/厘米² 以模拟不同的生理流动条件。
   2. 流动室（自行设计）由金属框架和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成的灌注室组成。通过连接高精度输注泵（PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, USA），可产生0.0001 µl/min至220.82 ml/min范围内的流速。
   3. 将管路连接至流室上部，并向管路中注入培养基。轻轻将流室上部置于下部之上，组装流室。注意避免产生气泡。通过流室注入1 ml培养基，以确认流室无泄漏，并去除多余的包被溶液。避免引入气泡。
   4. 将小鼠置于显微镜载物台上的温控加热垫上，温度保持在 37 °C。由于该操作为终末性实验步骤，无需严格进行无菌操作。在颈静脉附近做切口，轻轻分离右侧颈肌，从周围组织中游离出颈静脉。
   5. 设置输液泵和荧光显微镜。输液泵的参数设置取决于注射器直径和所需的流速。此后操作均在暗室中进行。
   6. VWF 包被：
      1. 用荧光标记的细菌填充注射器，并将其连接至进样管。避免产生气泡。启动输液泵，持续10分钟。输液时间取决于剪切速率以及所使用的包被材料、细菌和培养基，应能代表黏附的稳态状态。
      2. 10分钟后，将装有PBS的注射器连接到入口管，启动输液泵，以冲洗未结合的细菌。
      3. 在洗涤过程后，于不同位置至少采集15张图像或视频。细菌体积较小，可能难以聚焦。在开始之前 体外 流动实验中，可通过在盖玻片上滴加荧光标记的细菌，并将盖玻片置于流动池中来获取合适的焦平面。随后，寻找合适的焦平面并保存设置。
         注意： 在……期间 体外 流式实验中，在洗涤步骤期间（开始后约 ± 5 分钟）采集图像，可确保仅捕获黏附细菌的信号。
   7. 内皮细胞：
      1. 通过灌注0.1 mM的Ca溶液激活内皮细胞²⁺-离子载体A23187（储存液为10 mM，溶于二甲基亚砜（DMSO）中），在与细菌灌注相同的剪切速率下，以0.1 mM浓度的DMEM溶液灌注10分钟。
4. 按如下方法计算剪切速率和剪切应力。
   剪切速率 = 6Q/wh²
   其中：Q：流速，单位为 ml/min；w：宽度，单位为 cm；h：高度，单位为 cm
   剪切应力（τ）= 剪切速率 × 黏度（µ）
   其中 µ：介质：0.01 达因 × 秒/厘米² ，全血：0.04 达因×秒/厘米²
5. 图像分析
   1. 使用配备黑白相机的倒置荧光显微镜获取活体图像，并通过成像软件进行分析。曝光时间为1.5秒。在流动腔涂覆表面随机选取多个区域（至少15个）拍摄图像，保存为适当的文件格式。
   2. 使用 ImageJ 进行图像分析。减去背景以从图像中去除平滑、连续的背景（Process – Subtract Background），并设定阈值以确定上下阈值，将灰度图像分割为感兴趣的特征。测量限定于阈值范围内的面积。
   3. 比较以荧光面积表示的细菌黏附情况 例如， 使用统计分析软件。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或双尾Student’s t检验进行组间比较。所有数值均以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。将p < 0.05视为具有统计学意义。 p-值 <0.05 显著水平（* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001).

结果

图1. 一种示意图表示 体外 流动模型 该 体外 流动模型是一种多功能模型，可用于研究多种依赖剪切力的机制，例如细菌对内皮下基质的黏附以及血栓形成。微平行流动腔室置于含有不同蛋白涂层或内皮细胞的盖玻片（塑料或玻璃材质）上。可分析不同细菌（橙色和灰色点）的黏附情况，并评估血浆蛋白、血小板及全血存在下的影响。可结合使用血小板荧光标记物（蓝色椭圆形）或纤维蛋白原（蓝色条状）与不同抑制剂（黑色椭圆形），以区分细菌因素与宿主因...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脑心浸液培养基（BHI）	BD Plastipak	237500
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）	Oxoid	CM0129
磷酸盐缓冲液（PBS）	Invitrogen	14190-169	D-PBS
5(6)-羧基荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯	Sigma-Aldrich	21878-25MG-F	荧光标记
牛血清白蛋白V组分（BSA）	Roch	10 735 086 001
Haemate-P	CSL Behring	PL 15036/0010	VWF
Horm 胶原	Takeda	10500	胶原
单孔PCA细胞培养腔	Sarstedt	94.6140.102	塑料载片