一种用于研究剪切力依赖性细菌黏附的体内模型

摘要

来源：Claes, J., et al，在流动条件下研究细菌对血管壁黏附的体外与体内模型。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了一种在活体小鼠模型中分析剪切力依赖性细菌黏附的体内方法。经过外科准备和插管后，暴露肠系膜血管系统，以便在荧光显微镜下进行实时成像。通过灌注离子载体和荧光标记的细菌，可观察到剪切应力如何触发血管性血友病因子（VWF）纤维的形成以及细菌在内皮表面的聚集。

方案

1. 体内 肠系膜灌注模型
   1. 小鼠的准备/手术
      1. 实验前一晚禁食小鼠，以减少肠道蠕动。
      2. 对6-8周龄的小鼠（C57Bl/6）在手术前20-30分钟皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg体重（BW））进行术前镇痛。
      3. 通过腹腔注射氯胺酮（125 mg/kg BW）和赛拉嗪（12.5 mg/kg BW）麻醉小鼠。通过足底反射检查麻醉深度。涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
      4. 将小鼠置于显微镜载物台上的温控加热垫上，保持体温在37 °C。由于该操作为终末性实验，无需严格无菌操作。在颈静脉附近做切口，轻柔分离右侧颈肌组织，并将颈静脉从周围组织中游离出来。
      5. 将一根2 French静脉导管插入右侧颈静脉，用于输注荧光标记的细菌或其他溶液。通过腹部正中切口打开腹腔，使用棉签展开肠系膜，以便观察肠系膜小动脉和小静脉的循环情况。
      6. 将小鼠置于透明板的右侧，并用胶带固定导管。使用保温袋防止低体温。为防止组织脱水，向肠道滴加500 µl 0.9%氯化钠（NaCl）溶液。
2. 细菌在肠系膜循环中黏附的荧光显微镜观察
   1. 在暗室中操作。使用棉签固定血管，并在倒置显微镜下观察血管结构。
   2. 局部应用5 µl溶于二甲基亚砜（DMSO）中的10 mM Ca²⁺-离子载体A23187溶液。10秒后，经颈静脉导管注射100 µl标记过的细菌。采集延时图像。实验结束后，根据机构批准的指南实施安乐死。
3. 图像分析
   1. 使用倒置荧光显微镜获取活体图像，通过黑白相机采集，并使用任意成像软件进行处理。根据所用设备特性，自动调整曝光时间和对比度。
   2. 使用工具栏中的“采集”工具（多维采集—时间模式），设置40个循环，每秒采集1,000帧图像。将图像保存为合适的图像文件格式。
   3. 使用ImageJ分析软件处理图像，测量每张图像中荧光信号的面积。设定阈值以确定上下限，将灰度图像分割为感兴趣的特征区域。圈定感兴趣区域（血管），并仅在该区域内结合阈值测量荧光面积。使用任意统计或绘图软件比较细菌黏附情况，结果以荧光面积表示（图1）。

结果

图1. 实验流程示意图 体内 肠系膜灌注模型。通过插入右侧颈静脉导管（黄色线条）给予荧光标记的细菌（橙色点）、额外麻醉剂或其他成分，如药物抑制剂和抗体。打开腹腔，展平肠系膜，以便在荧光显微镜下观察血管（静脉和动脉）。通过Ca²⁺激动剂对内皮进行药理学激活后²⁺-离子载体，可诱导VWF释放，随后通过颈静脉导管注射细菌。实时血管内视频显微镜技术可实现 体内 循环荧光标记细菌的可视化及其导致的细菌-血小板血栓形成

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丁丙诺啡	Reckitt Benckiser	283716	布托啡诺
阿内斯克汀（氯胺酮盐酸盐 115 mg/ml（100 mg/ml 氯胺酮））	Eurovet	BE-V136516	氯胺酮
XYL-M 2%（盐酸赛拉嗪 23.32 mg/ml（相当于赛拉嗪 20 mg/ml））	VMD Arendonk	BE-V170581	赛拉嗪
2号绿色法国静脉导管	Portex	200/300/010
0.9% 氯化钠（NaCl）	Baxter Healthcare	W7124
棉签	国际医疗器械产品	300230
Ca2+A23187 离子载体溶液	Sigma-Aldrich	C7522-10 MG
26 号 1 ml 注射器	BD Plastipak	300013
26 号 1 ml 带针注射器	BD Plastipak	300015	腹腔注射
Centrifuge 5810-R	Eppendorf	5811 000.320
玻璃盖玻片（24×50）	VWR	BB02405A11	厚度编号 1
PHD 2000 注射泵	哈佛仪器	702100	高精度哈佛注射泵
Axio-observer DI	卡尔·蔡司	倒置荧光显微镜
ImageJ	美国国立卫生研究院	分析软件
Graphpad Prism 5.0	Graphpad 软件	分析软件
AxioCam MRm	卡尔·蔡司	黑白相机